이 방법은 혈관이 동맥 경화증의 발달에 지역적인 다름이 있는 이유와 같은 내피 생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 전단 응력 또는 다중 전단 응력 조건 하에서 여러 조건을 동시에 연구할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 각종 유량 및 패턴이 이용될 수 있기 때문에 동맥 과 정맥 시스템 둘 다에 있는 내피 유전자 조절을 이해하는 쪽으로 확장합니다.
여기서는 꾸준한 라미나르 흐름을 사용하는 시스템을 시연합니다. 설정은 방해된 흐름을 포함하여 다른 흐름 패턴에 맞게 조정할 수 있습니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 실험의 기간 내내 세포의 연속 단층을 유지하고 실험 사이 일관된 결과를 얻기 위하여 투쟁할 것입니다.
분석 24시간 전에, 인간 내피 세포를 초기 통로에서 세고 4웰 세포 배양판의 웰당 1개의 fibronectin 코팅 유리 슬라이드에 1밀리리터의 1밀리리터에서 6세포에 약 10회 종자한다. 셀이 섭씨 37도에서 15분 동안 슬라이드에 부착되도록 합니다. 그런 다음 각 슬라이드를 3 밀리리터의 매체로 덮고 24시간 동안 섭씨 37도, CO2 5%의 세포 배양 배양에 플레이트를 놓습니다.
실험 당일, 조정 가능한 CO2 및 열, 또는 해변 인큐베이터로 대형, 가열된 내장 환경의 물 트레이를 여러 선반, 내부 전기 액세스 및 유리 문으로 채우고 실험에 적절한 이산화탄소를 사용할 수 있는지 확인하고 CO2 모니터가 기능적이다는 것을 확인합니다. 유동 챔버를 설정하려면 1/8 인치 여성 미끼를 숫자 16 소프트 튜브의 한쪽 끝에 삽입하고 미끼에 4 방향 스톱콕을 부착하십시오. 튜브의 프리 엔드를 상단 플레이트의 유입 측에 부착하고 1/8 인치 남성 미끼를 두 번째 번호 16 소프트 튜브의 한쪽 끝에 삽입합니다.
남성 미끼에 4방향 스톱콕을 부착하고 튜브의 자유 끝을 상단 플레이트의 유출 측에 부착합니다. 1/8 인치 남성 미끼와 1/8 인치 암컷 미끼를 세 번째 번호 16 소프트 튜브의 각 끝에 삽입하고 1/8 인치 남성 미끼를 통해 버블 트랩에 튜브를 부착하십시오. 그런 다음 여성 미끼를 통해 튜브의 다른 쪽 끝에 4 방향 스톱콕을 부착합니다.
멸균 핀셋을 사용하여, 하단 플레이트의 오목으로 1 개의 셀 시드 유리 슬라이드를 전송, 세포 시드 측. 10 밀리리터 주사기를 사용하여 접시 주위의 붉은 개스킷 라인 내의 하단 플레이트에 따뜻한 매체 10 밀리리터를 추가합니다. 매체가 슬라이드를 통해 흐르고 셀을 덮도록 허용합니다.
상단 플레이트를 아래쪽 플레이트에 부드럽게 놓고 측면을 정렬하고 플레이트를 단단히 나사로 고정시하십시오. 버블 트랩에서 기포를 제거하려면 먼저 유입 및 버블 트랩 스톱콕을 열고 유출 스톱콕을 닫습니다. 그런 다음 30 밀리리터 주사기를 사용하여 접시를 통해 따뜻한 매체 20 밀리리터를 부드럽게 플러시합니다.
챔버에서 거품을 제거하려면 버블 트랩 스톱콕을 닫고 유출 스톱콕을 엽니다. 챔버의 유출 면을 45도 각도로 높이고 30 밀리리터 주사기를 사용하여 챔버의 유입 측에서 따뜻한 배지 20 밀리리터를 부드럽게 플러시합니다. 흐름 의 방향으로 적절한 속도로 플러시하고 세포의 컨리치 단층이 라미나르 흐름에 세포를 노출하기 전에 남아 있는지 확인하기 위해 현미경을 사용하는 것이 중요합니다.
그런 다음 챔버와 캡의 양쪽에 스톱콕을 닫고 세포가 여전히 가벼운 현미경 아래 슬라이드에 부착되어 있는지 확인합니다. 유동 챔버와 이전에 조립된 흐름 루프 시스템을 해변에 배치하고 펌프를 완전히 일시 중지하기 전에 흐름 루프 어셈블리의 펌프 속도를 천천히 줄입니다. 누설을 방지하고 스톱콕을 통해 챔버와 루프 시스템을 함께 연결하려면 흐름 루프 시스템의 스톱콕을 닫습니다.
모든 루프가 연결되면 모든 스톱콕을 다시 열고 누출 또는 막힘에 대한 설정을 모니터링하면서 펌프 속도를 느리게 늘립니다. 유동 센서를 유량 방향으로 지향하는 챔버의 유입 측의 챔버 브리지 튜브에 유동 센서를 배치하고 펌프 속도를 조정하여 전단 응력 속도에 대한 유량을 획득한다. 그런 다음 CO2 탱크를 켜서 5%C02 농도를 달성합니다.
실험 유동 기간이 완료되면 연동 펌프 속도를 0으로 천천히 줄이고 전원을 끕니다. 모든 오픈 스톱콕을 빠르게 닫고 챔버와 연결된 튜브를 양쪽에 스톱콕으로 옮기고 깨끗한 벤치 탑으로 옮춥힙을 옮춥힙. 모든 나사를 조심스럽게 풀어 상단 플레이트를 제거하고 바늘 코 핀셋을 사용하여 하단 플레이트에서 100mm 직경의 접시로 유리 슬라이드를 전달합니다.
차가운 PBS의 10 밀리리터에서 슬라이드를 세척하고 현미경의 밑에 세포를 확인하여 혈류 방향으로 세포 준수 및 정렬을 확인하십시오. PBS를 심은 후 슬라이드를 깨끗한 100mm 직경 의 접시로 옮기고 RNA 추출 키트에서 1/100번째 베타-메르카토에탄올로 보충된 350마이크로리터의 용액 버퍼를 슬라이드에 추가합니다. 폴리에틸렌 블레이드 셀 스크레이퍼를 사용하여 슬라이드에서 세포를 긁어 내고 조직 배양 접시를 기울여 버퍼가 바닥에 풀링되도록 합니다.
집게를 사용하여 셀이 얼음 위에 있는 1.5 밀리리터 튜브로 셀용자염을 제거하고 파이펫을 제거합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 다운스트림 RNA 절연 및 분석을 위해 세포 용액에 희석 된 루시파라제 RNA 10 마이크로 리터를 추가합니다. 제한 효소를 사용하여 루시파아래스 플라스미드의 성공적인 선형화는 아가로즈 젤에 소화된 제품을 실행하고 선형화된 제품의 크기를 DNA 사다리로 확인하고 절단되지 않은 플라스미드와 비교하여 확인할 수 있다.
제조 공정은 챔버 높이의 작은 변화로 이어질 수 있으므로 동일한 전단 응력을 달성하기 위해 각 챔버에 대해 유량을 계산해야합니다. 포유류 내피 세포에 라미나르 전단 응을 통합한 실험의 경우, 반딧불 루시파라제 RNA는 외인성 RNA 스파이크인으로 사용될 수 있다. 내인성 기준 유전자, 외인성 기준 유전자, 그리고 내인성 및 외인성 기준 유전자모두모두 유사한 결과를 낳는다.
참고, 이러한 대표적인 실험에서 각 실험에 대해 하나의 파스칼에서 전단 응력으로 두 개의 동시에 흐르는 유동 챔버를 사용하는 이러한 대표적인 실험에서, Kruppel은 SI-RNA를 통해 두 개의 녹다운과 같은 것으로 테스트된 생물학적 샘플 간의 유사한 녹다운 효율을 산출하였다. 이 절차를 시도하는 동안 슬라이드에 세포의 균일 한 단층을 설정하고 흐름 챔버를 부착하기 전에 흐름 루프 시스템을 profuse하는 것이 중요합니다. 이 절차에 이어 RNA 염기서열 분석과 같은 다른 방법은 DNA 및 단백질과 같은 게놈 넓은 RNA 발현 및 기타 판독을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 추가 분자 분석을 위해 사용될 수 있다.
개발 후, 이 기술은 인체 생물 의 내피 세포에서 전단 스트레스와 혈관 신생 잠재력 사이의 관계를 탐구하는 내피 생물학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.
