Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen auf dem Gebiet der Endothelbiologie zu beantworten, wie zum Beispiel, warum haben Blutgefäße regionale Unterschiede in der Entwicklung von Arteriosklerose? Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Bedingungen unter Scherspannung oder mehrfachen Scherspannungsbedingungen ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik reichen auf das Verständnis der endotheliaalen Genregulation sowohl in den arteriellen als auch in venösen Systemen, da verschiedene Durchflussraten und Muster verwendet werden können.
Nun, hier zeigen wir ein System, das einen stetigen laminaren Fluss verwendet. Das Setup kann für andere Strömungsmuster, einschließlich gestörter Strömung, angepasst werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben, während der gesamten Dauer des Experiments eine kontinuierliche Monoschicht von Zellen aufrechtzuerhalten und konsistente Ergebnisse zwischen den Experimenten zu erzielen.
24 Stunden vor der Analyse zählen Sie die menschlichen Endothelzellen in einem frühen Durchgang und säen etwa ein mal 10 zu den sechsten Zellen in einem Milliliter Medium auf einen fibronectin beschichteten Glasschlitten pro Brunnen einer Vier-Well-Zell-Kulturplatte. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten bei 37 Grad Celsius an der Folie haften. Dann bedecken Sie jede Rutsche mit drei Millilitern Medium und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator von 37 Grad Celsius und 5% CO2 für 24 Stunden.
Füllen Sie am Tag des Experiments die Wasserwanne einer großen, beheizten, eingebauten Umgebung mit einstellbarem CO2 und Wärme oder Strand-Inkubator mit mehreren Regalen, internem Stromanschluss und Glastüren und bestätigen Sie, dass ausreichend Kohlendioxid für das Experiment zur Verfügung steht und dass der CO2-Monitor funktionsfähig ist. Um die Strömungskammer einzurichten, legen Sie einen 1/8 Zoll weiblichen Köder in ein Ende eines Weichenrohres der Zahl 16 ein und befestigen Sie einen Vier-Wege-Stoppamchen am Köder. Befestigen Sie das freie Ende des Rohres an der Zuflussseite der oberen Platte und legen Sie einen 1/8 Zoll männlichen Köder in ein Ende einer zweiten Zahl 16 weichen Rohr.
Befestigen Sie einen Vier-Wege-Stoppamchen am männlichen Köder, und befestigen Sie das freie Ende des Rohres an der Abflussseite der oberen Platte. Legen Sie einen 1/8 Zoll männlichen Köder und einen 1/8 Zoll weiblichen Köder in jedes Ende einer dritten Zahl 16 weiches Rohr, und befestigen Sie die Schläuche an einer Blasenfalle über die 1/8 Zoll männlichen Köder. Dann befestigen Sie einen Vier-Wege-Hahn am anderen Ende der Schläuche über den weiblichen Köder.
Übertragen Sie mit steriler Pinzette eine Zelle gesäte Glasrutsche in die Aussparung auf der Bodenplatte, zellgesät eatiert nach oben. Verwenden Sie eine 10 Milliliter Spritze, um 10 Milliliter warmes Medium auf die untere Platte innerhalb der roten Dichtungslinie um die Platte hinzuzufügen. Das Medium kann durch das Dia fließen und die Zellen abdecken.
Legen Sie die obere Platte vorsichtig auf die Bodenplatte, um die Seiten auszurichten und die Platten fest zusammenzuschrauben. Um Luftblasen aus der Blasenfalle zu entfernen, öffnen Sie zuerst den Zufluss und Blasenfalle Stoppcocks und schließen Sie den Abfluss-Stopphahn. Dann verwenden Sie eine 30-Milliliter-Spritze, um 20 Milliliter warmes Medium vorsichtig durch die Platte zu spülen.
Um Blasen aus der Kammer zu entfernen, schließen Sie den Blasenfalle-Stopphahn und öffnen Sie den Abfluss-Stopphahn. Heben Sie die Abflussseite der Kammer auf einen 45-Grad-Winkel und verwenden Sie die 30-Milliliter-Spritze, um 20 Milliliter warmes Medium sanft von der Zuflussseite der Kammer zu spülen. Es ist wichtig, mit einer angemessenen Rate in Richtung des Flusses zu spülen und das Mikroskop zu verwenden, um zu bestätigen, dass eine konfluente Monoschicht von Zellen verbleibt, bevor die Zellen dem laminaren Fluss aussetzen.
Schließen Sie dann die Hahnen auf beiden Seiten der Kammer und Kappe und bestätigen Sie, dass die Zellen noch unter einem Lichtmikroskop am Dia befestigt sind. Legen Sie die Durchflusskammer und ein zuvor montiertes Durchflussschleifensystem in den Strand und verringern Sie langsam die Pumpendrehzahl der Durchflussschleifenbaugruppe, bevor Sie die Pumpe vollständig pausieren. Schließen Sie die Stopphähne am Durchflussschleifensystem, um Leckagen zu verhindern, und verbinden Sie das Kammer- und Schleifensystem über Stoppcocks miteinander.
Wenn alle Schleifen angeschlossen sind, öffnen Sie alle Stoppcocks wieder und erhöhen Sie langsam die Pumpengeschwindigkeit, während Sie das Setup auf Leckagen oder Blockaden überwachen. Platzieren Sie den Durchflusssensor auf den Kammerbrückenschlauch der Zuflussseite der Kammer mit dem sensorisch in Strömungsrichtung ausgerichteten Sensor und passen Sie die Pumpengeschwindigkeit an, um den Durchfluss für die Scherspannung von Interesse zu erhalten. Schalten Sie dann den CO2-Tank ein, um eine Konzentration von 5% C02 zu erreichen.
Sobald die experimentelle Durchflussperiode abgeschlossen ist, verringern Sie langsam die peristaltische Pumpengeschwindigkeit auf Null und schalten Sie die Leistung aus. Schließen Sie schnell alle offenen Hahnen und übertragen Sie die Kammer und die angeschlossenen Schläuche mit einem Stopphahn auf jeder Seite auf eine saubere Bankplatte. Lösen Sie vorsichtig alle Schrauben, um die obere Platte zu entfernen und verwenden Sie NadelNase Pinzette, um die Glasrutsche von der Bodenplatte auf eine Schale mit 100 Millimeter Durchmesser zu übertragen.
Waschen Sie den Schlitten in 10 Milliliter kaltes PBS und überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Zellhaftung und Ausrichtung in Strömungsrichtung zu bestätigen. Nach dem Anspirieren des PBS den Schlitten auf eine saubere Schale mit 100 MillimeterDurchmesser übertragen und 350 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen, ergänzt durch 1/100. Beta-Mercaptoethanol aus einem RNA-Extraktionskit auf den Dia. Verwenden Sie einen Polyethylen-Blatt-Zellschaber, um die Zellen vom Schlitten abzukratzen und die Gewebekulturschale zu kippen, damit sich der Puffer am Boden bündeln kann.
Verwenden Sie Zangen, um den Schlitten zu entfernen und pipette die Zelle lysiert in eine 1,5 Milliliter Rohr auf Eis. Dann fügen Sie 10 Mikroliter verdünnter Luziferase-RNA in das Zelllysat für die nachgeschaltete RNA-Isolierung und -Analyse nach Standardprotokollen ein. Eine erfolgreiche Linearisierung des Luziferase-Plasmids mit Restriktionsenzymen kann durch ausführen der verdauten Produkte auf einem Agarosegel bestätigt und die Größe des linearisierten Produkts kann mit DNA-Leitern und im Vergleich zu einem ungeschnittenen Plasmid bestätigt werden.
Fertigungsprozesse können zu kleinen Schwankungen der Kammerhöhe führen, so dass die Durchflussmenge für jede Kammer berechnet werden muss, um die gleiche Scherspannung zu erreichen. Für Experimente mit laminarem Scherstress in Säugetieren-Endothelzellen kann Galle-Luziferase-RNA als exogene RNA-Spike-in verwendet werden. Die Normalisierung des endogenerischen Referenzgens, des exoogenen Referenzgens, sowie der endogene und der exogenen Referenzgene zusammen führt zu ähnlichen Ergebnissen.
Bemerkenswert ist, dass Kruppel in diesen repräsentativen Experimenten mit zwei gleichzeitig laufenden Strömungskammern mit Scherspannung bei einem Pascal für jedes Experiment eine ähnliche Knockdown-Effizienz zwischen den getesteten biologischen Proben ergab. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, eine gleichmäßige Monoschicht von Zellen auf dem Dia zu etablieren und das Durchflussschleifensystem vor dem Anbringen der Durchflusskammer zu überziehen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die RNA-Sequenzierung, verwendet werden, um die genomweite RNA-Expression zu bewerten, und andere Auslesungen, wie DNA und Protein, können für weitere molekulare Analysen verwendet werden.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Endothelbiologie, um den Zusammenhang zwischen Scherstress und angiogenem Potenzial in menschlichen Endothelzellen zu erforschen.
