Bu yöntem, hymenoptera moleküler biyoloji ve genetik alanlarda anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, cinsiyet belirleme sistemleri gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, genetik haritalama ve moleküler durum için gerekli olan Vollenhovia Emery antı üzerinde kolayca üreme çizgileri inbreeding hatları ikna edebilirsiniz. Yani, bu misyon belirli bir karıncanın cinsiyet belirleme sistemi içine fikir sağlayabilir ve aynı zamanda diğer karıncalar ve diğer Hymenoptera türler, eşek arıları gibi uygulanabilir.
Protokole başlamak için, yaz başında V.Emeryi kolonilerini toplayın. Toplanan dallardan karınca örneklerini bir aspiratör kullanarak cam kapaklı yapay bir alçı yuvaya aktarın. 16 ila sekiz saatlik açık-koyu bir döngü altında, 25 derece C yapay yuvada koloniler koruyun.
Aynı anda her gün alçı nemli tutmak için bir yıkama şişesi ile musluk suyu sağlayın. Daha sonra, yeni üreme karıncalar ortaya çıkana kadar her gün 20 mikrolitre ucu kullanarak, alüminyum folyo ve kahverengi şeker su dolu ucu sarılmış kuru kriket tozu yaklaşık 100 mikrogram ekleyin. Bu alanlardan mikro koloniler toplamak ve onlara yeni kraliçeler ve erkekler kazanmak için yeterli yiyecek sağlamak için önemlidir.
İlk olarak, 15 dakika boyunca dört derece santigrat ayarlanmış kontrollü bir ortama sahip bir odaya koloniler yerleştirerek bireylerin hareket durdurmak. Sonraki inbreeding haçlar üretilen işçilerden F-sıfır nesil ayırt etmek için bir stereoskop altında forceps kullanarak 30 işçi karıncaların orta bacaklarını çıkarın. Sonra karıncalar yeni bir küçük alçı yuva içine inbreeding haçlar için aktarın.
Daha sonra, işçilerin içeren bir alçı yuva içine üç ila dört larva veya pubekleyin. Uzun kanatlı bir kraliçe ve bir erkek daha önce hazırlanmış alçı yuva içine inbreeding haçlar için aktarın. Bu adım için, normal bir koloni ile aynı durumda deneysel geçiş kolonikorumak önemlidir.
Sadece erkek ve dişileri bir araya getirerek üremeyi teşvik etmek zordur. Kolonileri 16-8 saatlik bir ışık altında 25 derecede tutun, kraliçe kanatlarını kaybedip yumurtlayıncaya kadar yiyecek ve su sağlanan karanlık döngü. Deneysel koloniyi her gün stereo mikroskop altında kontrol edin.
F-one yavruları arasında inbreeding haçlar kurduktan sonra, yumurta bir stereoskop altında görülebilir. F-one kraliçesi yumurtlamaya başladıktan sonra, F-one neslinin ve F-iki kuşağının karışmasını önlemek için yuvadan F-one erkekleri ve larvaları veya pube'leri çıkarın. F-2 yavruları ortaya çıkana kadar kolonileri aynı koşullarda tutun.
Bir F-zero kraliçesinin bir bacağını forceps kullanarak çıkarın. Bacağı 100 mikrolitre soğuk luk maddesi içeren 1,5 mililitrelik mikro tüpe aktarın. Bir stereoskop altında bir cam çanak içinde bir kadın karın incelemek 300 ultra saf su 300 mikrolitre ile dolu forceps kullanarak.
Çiftleşmeli erkeklerin spermiçeren spermatica sissimilate. Spermatica doku soyma ve böcek pimleri kullanarak kadın dokusundan sperm izole. Bir mikro pasta pedkullanarak, bir chill ajan 100 mikrolitre içeren 1.5 mililitrelik mikro tüp içine sperm aktarın.
F-zero kraliçesi ve spermden alınan örnekleri 20 dakika boyunca 95 derecede kuluçkaya yatırın. Flash centro mikro tüpü kaynaştırır ve numuneleri dört santigrat derecede saklar. Siv-mated F-one kraliçesi tarafından yumurta üretimini doğruladıktan sonra, döken kanatları veya bir orta bacak ve genotip kullanarak kraliçenin DNA ayıklayın.
Sonra, bir bacak genotipleyerek bir F-one erkek DNA ayıklayın. Üreme haçlar erkek karıncaların doğurganlık değerlendirmek için, forseps kullanarak PBS çözeltisi 400 mikrolitre ile cam bir çanak iç üreme organları incelemek. Sonra PBS çıkarın ve bir mikro pasta ped kullanarak yüzde dört paraformaldihyde ile değiştirin.
PfA'daki numuneleri oda sıcaklığında kırk dakika kuluçkaya yatırarak dokuyu düzeltin. Fiksasyondan sonra, bir mikro pasta pedi kullanarak 400 mikrolitre PBS ile dokuları beş kez yıkayın. PBS'de mililitre başına bir miligrama seyreltilmiş DAPI çözeltisi.
PBS çıkarın ve dokuya seyreltilmiş DAPI boyama çözeltisi yaklaşık 300 mikrolitre ekleyin. Karanlık koşullarda bir oda sıcaklığında 15 dakika boyunca doku kuluçka. Kuluçkadan sonra, 400 mikrolitre PBS ile beş kez doku yıkayın ve plüps kullanarak bir cam slayt merkezine doku aktarın.
Daha sonra tritc tetrametietiloidin içeren montaj ortamına doku monte edin. Son olarak 20 veya 60 3x objektif lensler kullanarak bir konfokal lazer tarama mikroskop ile örnekleri gözlemleyin. Haploid erkek v Emeryi testislerinin mikroskobik görüntüleri, sağlıklı fibröz doku göstermeyen Diploid male v Emeryi'de bulunmayan sağlıklı fibröz doku veya spermi göstermektedir.
Diploid erkek v Emeryi'nin erkek üreme organları sperm üretmedi ve testisleri gelişmedi, bu da inbreeding haçlarda üretilen erkeklerin steril olduğunu düşündürmektedir. Gelişiminden sonra, bu teknik bize hızlı zamanlama karınca türleri için Vollenhovia Emeryi bir sabit seks miatony keşfetmek için yol açtı.
