Bu yöntem haplotip çeşitliliği ve bunun hastalıkla nasıl ilişkili olduğu gibi NK hücre reseptör genetiği ile ilgili anahtar soruları yanıtlayabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, otomasyon süreci ve veri analizi de dahil olmak üzere laboratuarınızdaki protokolün ayarlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin başlıca avantajları, geleneksel yöntemlerin aksine, nicel KIR otomatik yazımı anlamına gelen qKAT'ın yüksek iş sahibi olması ve gen kopya numarası sağlamasıdır.
qKAT hastalık ilişkisi hakkında bilgi verebilir. Bu tekniğin etkileri HIV ve hepatit C gibi viral enfeksiyonlar için tedavi için yararlı olabilir, kanser, kök hücre nakli, ve gebelik bozuklukları. qKAT, kir ve HLA molekülleri arasındaki ekspresyon ve fonksiyonel etkileşimlerin araştırılmasının yanı sıra popülasyon genetiğinin incelenmesinde de uygulanabilir.
qKAT, özellikle iki KIR geninin eksonlarını ve bir referans genini hedef alan 10 çokkatlı reaksiyondan oluşur. Bu protokolde, belirli astarlar verilen genin alellerini tespit etmek için tasarlanmıştır ve PCR sonuçları kısa amplikonlarla sonuçlanır. Bundan sonra, pcr amplifikasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için çift etiketli spesifik hidroliz probları kullanılır.
Kopya numarası analizi, hedef KIR genlerinin bir referans genine göreli niceliğini kullanır. qKAT yüksek iş yapma tekniği olarak tasarlanmış ve ayarlanmıştır. Bu nedenle, her reaksiyon 1.000 numunenin hemen altında yapılabilir.
Aşağıdaki adımlar, her 96 kuyulu DNA plakasının hazırlanması ve kapamasında yer alan adımları göstermektedir. Başlangıç olarak, DNA'yı ölçtükten sonra, DNA'yı 96 kuyuluktaki bir plakada seyreltin. Bilinen bir kopya numarası ve şablon olmayan bir denetimiçeren en az bir denetim örneği ekleyin.
Plakayı 450 gs'de iki dakika santrifüj edin. Daha sonra, 384-iyi qPCR plakaları içine dört katına her örnek dağıtmak. Bundan sonra, hava 24 saat boyunca oda sıcaklığında temiz bir alanda DNA kuru.
10 384-iyi plakalar için bir qKAT reaksiyonu ayarlamak için, ilk, qPCR tampon, astar defrost ve dört santigrat derece aliquots prob aliquots. Ana karışımı metin protokolüne göre buz üzerinde hazırlayın. Daha sonra, ana karışımı 96 kuyulu derin kuyuplakasına eşit olarak dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
Kurutulmuş gDNA örnekleri ile plakanın her kuyuya ana karışımın 9,5 mikrolitresini dağıtın. Bundan sonra, folyo ile plaka mühür ve hemen dört derece santigrat de saklayın. Birden fazla 384-well DNA plakası üzerinde ana karışımı dağıtım eğer sıvı işleme sisteminin iğneleri temizlemek için kısa bir su yıkama yapmayı unutmayın.
Plakayı 450 gs'de gDNA örnekleriile üç dakika santrifüj edin. Daha sonra, DNA'yı yeniden askıya almak ve hava kabarcıklarını dağıtmak için plakayı 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Plakayı bir gecede kuluçkaya yatırdıktan sonra, hava kabarcıklarını dağıtmak için santrifüjü tekrarlayın.
Ardından, plakayı soğutulmuş depoya yerleştirin. QPCR makinesini bir mikroplaka işleyicisine bağlayın. Daha sonra, mikroplaka işleyicisini metin protokolüne göre programlayın.
Çalışma tamamlandıktan sonra, robotqPCR makineden plaka toplamak ve atmak dock yerleştirin. Amplifikasyon tamamladıktan sonra qPCR yazılımını açın. Navigator sekmesinin altında, kaydedilen reaksiyon deneme dosyasını bir plaka için açın.
Ardından, Yeni Çözümleme Oluştur penceresini açın ve 2. Ardından Filtre Tarak'ı seçin ve STAT6 için toplanan verilerin seçildiğinden emin olun. Uygun renk telafisini seçin.
Hesapla'yı tıklatın ve ardından dosyayı kaydet'i tıklatın. Verileri Fit Points yöntemiyle çözümlemek için yeni çözümleme penceresi açın ve Fit Points yöntemi için uygun ayarları seçin. Ardından, STAT6 için doğru filtreleri ve renk karşılıklarını seçin.
Gürültü bandını arka plan gürültüsünü hariç tutmak için ayarlayın. Bundan sonra, Çözümsekmesini açın ve sığdırmazlık noktalarını üçe ayarlayın ve Sığdırmayı Göster'i seçin. Değişiklikleri kaydedin ve kir genleri için Fit Point ve 2.
QPCR yazılımında Navigator sekmesini açın ve Sonuç Toplu Dışa Aktarma'yı seçin. Ardından, deneme dosyalarını içeren klasörü açın ve bunları pencerenin sağ tarafına aktarın. İleri'yi tıklatın ve dışa aktarma dosyasının adını ve konumunu seçin.
Bundan sonra, ilgi alanının analiz türünü seçin ve İleri'yi tıklatın. Dışa aktarma işlemini başlatmak için İleri'yi tıklatmadan önce dosyanın adının, dışa aktarma klasörünün ve çözümleme türünün doğru olduğundan emin olun. Dışa aktarma durumu Tamam'a değiştiğinde, ekran otomatik olarak bir sonraki adıma taşınır.
Seçili dosyaların tümünün başarıyla dışa aktarıldığından emin olun ve Bitti'yi tıklatın. Ardından, dışa aktarılan plakaları tek tek tepkilere bölmek ve dosyaları kopya numarası çözümleme yazılımı yla okunabilir bir yazılıma dönüştürmek için metin protokolündeki komut dosyalarını kullanın. Ardından, kopya numarası çözümleme yazılımını açın ve komut dosyaları tarafından oluşturulan metin dosyalarını yüklemek için gerçek zamanlı PCR sonuç dosyasını içe aktar'ı seçin.
Son olarak, Çözümle'yi seçin ve en sık örnek kopya numarasını seçerek çözümleme gerçekleştirin. Bu protokolde, yarı otomatik yazı, veya qKAT, sayı tipi KIR genleri kopyalamak için kullanılmıştır. KIR2DL4 için en sık kopya numarası iki kopya iken KIR3DS1 için en sık kopya numarası sıfır dır.
Bu prosedürü denerken, DNA'nın doğru bir şekilde ölçülmediğinden emin olmak, buz üzerindeki tüm adımları gerçekleştirmek ve reaktiflerin ışıktan kaplandığından emin olmak son derece önemlidir. Ayrıca KIR genleri için bilinen LD kurallarına uymayan numuneler için ham veriler üzerinde kapsamlı kontroller yapmak da önemlidir. Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için sıralama gibi başka yöntemler de yapılabilir, örneğin, füzyon genlerinin varlığı veya yeni alellerin tanımlanması gibi.
Bu yöntem, geliştirilmesinden sonra, immünogenetik alanında araştırmacıların NK hücre biyolojisi, hastalık direnci ve insan üremesindeki KIR rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.
