Cette méthode peut répondre à des questions clés sur la génétique des récepteurs cellulaires NK telles que la diversité des haplotypes et comment cela se rapporte à la maladie. La démonstration visuelle de cette méthode aidera à définir le protocole dans votre laboratoire, y compris le processus d’automatisation et l’analyse des données. Les principaux avantages de cette technique sont que, contrairement aux méthodes conventionnelles, qKAT, qui signifie dactylographie automatisée quantitative KIR, est à haut débit et il fournit le numéro de copie génétique.
qKAT peut fournir un aperçu de l’association de la maladie. Les implications de cette technique peuvent être utiles pour le traitement des infections virales comme le VIH et l’hépatite C, dans le cancer, dans la transplantation de cellules souches et les troubles de la grossesse. qKAT peut également être appliqué dans l’étude de la génétique des populations ainsi que dans l’exploration de l’expression et des interactions fonctionnelles entre les molécules KIR et HLA.
qKAT se compose de 10 réactions multiplexes qui ciblent spécifiquement les exons des deux gènes KIR et d’un gène de référence. Dans ce protocole, des amorces spécifiques sont conçues pour détecter les allèles du gène donné et pcr se traduit par de courts amplicons. Après cela, des sondes d’hydrolyse spécifiques à double étiquetage sont utilisées pour surveiller l’amplification PCR en temps réel.
L’analyse du nombre de copies utilise la quantification relative des gènes KIR cibles à un gène de référence. qKAT est conçu et mis en place pour être une technique à haut débit. Par conséquent, chaque réaction peut être effectuée sur un peu moins de 1000 échantillons.
Les étapes suivantes montrent les étapes impliquées dans la préparation et le placage de chaque plaque d’ADN de 96 puits. Pour commencer, après la quantification de l’ADN, diluer l’ADN dans une plaque de puits profonds de 96 puits. Inclure au moins un échantillon de contrôle avec un numéro de copie connu et un contrôle non-modèle.
Centrifuger la plaque à 450 gs pendant deux minutes. Ensuite, distribuez chaque échantillon en quadruplicate en plaques qPCR de 384 puits. Après cela, séchez l’ADN dans une zone propre à température ambiante pendant 24 heures.
Pour configurer une réaction qKAT pour 10 plaques de puits de 384 puits, d’abord, décongeler le tampon qPCR, l’amorce et la sonde aliquots à quatre degrés Celsius. Préparer le master mix sur glace selon le protocole du texte. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour répartir le mélange principal uniformément sur une plaque de puits profonds de 96 puits.
Distribuez 9,5 microlitres du mélange principal dans chaque puits de la plaque avec les échantillons séchés d’ADN. Après cela, sceller la plaque avec du papier d’aluminium et la conserver immédiatement à quatre degrés Celsius. N’oubliez pas d’effectuer un court lavage à l’eau pour nettoyer les aiguilles du système de manipulation liquide si vous distribuez le mélange principal sur plus d’une plaque d’ADN de 384 puits.
Centrifuger la plaque avec les échantillons de gDNA à 450 gs pendant trois minutes. Ensuite, incubez la plaque à 4 degrés Celsius pour résusquer l’ADN et dissiper les bulles d’air. Après avoir incubé la plaque pendant la nuit, répétez la centrifugation pour dissiper les bulles d’air.
Ensuite, placez la plaque dans le quai de rangement refroidi. Connectez la machine qPCR à un gestionnaire de microplaque. Ensuite, programmez le gestionnaire de microplaque selon le protocole de texte.
Une fois la course terminée, demande au robot de récupérer la plaque de la machine qPCR et de la placer dans le quai de défausse. Après avoir terminé l’amplification, ouvrez le logiciel qPCR. Sous l’onglet Navigator, ouvrez le fichier d’expérience de réaction enregistré pour une plaque.
Ensuite, ouvrez la fenêtre Créer une nouvelle analyse et sélectionnez les paramètres appropriés pour la 2ème méthode Derivative Max. Sélectionnez ensuite Filter Comb et assurez-vous que les données collectées pour STAT6 sont sélectionnées. Sélectionnez la compensation de couleur appropriée.
Cliquez sur Calculer, puis cliquez sur enregistrer le fichier. Pour analyser les données avec la méthode Fit Points, ouvrez la nouvelle fenêtre d’analyse Créer et sélectionnez les paramètres appropriés pour la méthode Fit Points. Ensuite, sélectionnez les filtres corrects et les compensations de couleur pour STAT6.
Réglez la bande de bruit pour exclure le bruit de fond. Après cela, ouvrez l’onglet Analyse et réglez les points d’ajustement à trois, et sélectionnez Afficher les points d’ajustement. Enregistrez les modifications et répétez les étapes avec les paramètres appropriés pour Fit Point et la 2ème analyse dérivée pour les gènes KIR.
Ouvrez l’onglet Navigator dans le logiciel qPCR et sélectionnez Results Batch Export. Ensuite, ouvrez le dossier contenant les fichiers d’expérience et transférez-les sur le côté droit de la fenêtre. Cliquez ensuite et sélectionnez le nom et l’emplacement du fichier d’exportation.
Après cela, sélectionnez le type d’analyse d’intérêt et cliquez sur Suivant. Assurez-vous que le nom du fichier, le dossier d’exportation et le type d’analyse sont corrects avant de cliquer sur Suivant pour démarrer le processus d’exportation. Lorsque l’état d’exportation passe à OK, l’écran passe automatiquement à l’étape suivante.
Assurez-vous que tous les fichiers sélectionnés ont été exportés avec succès et cliquez sur Done. Ensuite, utilisez les scripts dans le protocole texte pour diviser les plaques exportées en réactions individuelles et pour convertir les fichiers en un logiciel lisible par un logiciel d’analyse de numéro de copie. Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse des nombres de copies et sélectionnez le fichier de résultats PCR en temps réel d’Importation pour charger les fichiers texte créés par les scripts.
Enfin, sélectionnez Analyser et effectuez l’analyse en sélectionnant le numéro de copie de l’échantillon le plus fréquent. Dans ce protocole, la dactylographie semi-automatisée, ou qKAT, a été utilisée pour copier des gènes KIR de type nombre. Le numéro de copie le plus fréquent pour KIR2DL4 était deux copies tandis que le numéro de copie le plus fréquent pour KIR3DS1 était zéro.
Tout en essayant cette procédure, il est extrêmement important de s’assurer que l’ADN est quantifié avec précision, de procéder à toutes les étapes sur la glace, et de s’assurer que les réhésifs sont couverts de lumière. Il est également important d’effectuer des vérifications approfondies des données brutes pour les échantillons qui ne sont pas conformes aux règles connues de LD pour les gènes KIR. Après cette procédure, d’autres méthodes comme le séquençage peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions, par exemple, la présence de gènes de fusion, ou l’identification de nouveaux allèles.
Après son développement, cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunogénétique pour explorer le rôle de kir dans la biologie cellulaire de NK, la résistance aux maladies, et la reproduction humaine.
