Diese Methode kann wichtige Fragen über NK-Zellrezeptorgenetik wie Haplotyp-Vielfalt und wie diese mit Krankheiten zusammenhängt beantworten. Die visuelle Demonstration dieser Methode hilft, das Protokoll in Ihrem Labor festzulegen, einschließlich des Automatisierungsprozesses und der Datenanalyse. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass qKAT, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die für quantitative skir automatisierte Typisierung steht, hochdurchsatzig ist und gen copy number liefert.
qKAT kann Einblicke in die Krankheitsassoziation geben. Die Implikationen dieser Technik können für die Therapie bei Virusinfektionen wie HIV und Hepatitis C, bei Krebs, bei Stammzelltransplantationen und Schwangerschaftsstörungen nützlich sein. qKAT kann auch bei der Untersuchung der Populationsgenetik sowie bei der Erforschung von Expression und funktionellen Wechselwirkungen zwischen KIR- und HLA-Molekülen angewendet werden.
qKAT besteht aus 10 Multiplex-Reaktionen, die speziell auf Exons der beiden KIR-Gene und ein Referenzgen abzielen. In diesem Protokoll sind spezifische Primer so konzipiert, dass sie die Allele des gegebenen Gens und pcR-Ergebnisse in kurzen Amplicons erkennen. Danach werden dual-labelierte spezifische Hydrolysesonden verwendet, um die PCR-Verstärkung in Echtzeit zu überwachen.
Die Kopiernummernanalyse verwendet die relative Quantifizierung der ZIEL-KIR-Gene zu einem Referenzgen. qKAT ist so konzipiert und eingerichtet, dass es sich um eine Hochdurchsatztechnik handelt. Daher kann jede Reaktion an knapp 1.000 Proben durchgeführt werden.
Die folgenden Schritte zeigen die Schritte, die bei der Vorbereitung und Beschichtung jeder 96-Well-DNA-Platte erforderlich sind. Zunächst, nach der Quantifizierung der DNA, verdünnen Sie die DNA in einer 96-Well-Tiefbrunnenplatte. Schließen Sie mindestens ein Steuerelementbeispiel mit einer bekannten Kopiernummer und ein Nicht-Vorlagensteuerelement ein.
Zentrifugieren Sie die Platte bei 450 g für zwei Minuten. Geben Sie dann jede Probe in Quadruplicate in 384-well qPCR-Platten. Danach trocknen Sie die DNA in einem sauberen Bereich bei Raumtemperatur 24 Stunden lang an der Luft.
Um eine qKAT-Reaktion für 10 384-Well-Platten einzurichten, zuerst den qPCR-Puffer, Primer und Sonde Aliquots bei vier Grad Celsius auftauen. Bereiten Sie den Master-Mix auf Eis gemäß dem Textprotokoll vor. Verwenden Sie dann eine Mehrkanal-Pipette, um den Master-Mix gleichmäßig über eine 96-Well-Tiefbrunnenplatte zu verteilen.
Mit den getrockneten gDNA-Proben 9,5 Mikroliter des Master-Mix in jeden Brunnen der Platte geben. Danach die Platte mit Folie versiegeln und sofort bei vier Grad Celsius aufbewahren. Denken Sie daran, eine kurze Wasserwäsche durchzuführen, um die Nadeln des Flüssigkeitshandhabungssystems zu reinigen, wenn der Dosiermaster auf mehr als einer 384-Well-DNA-Platte gemischt wird.
Zentrifugieren Sie die Platte mit den gDNA-Proben drei Minuten lang bei 450 g. Dann inkubieren Sie die Platte bei 4 Grad Celsius, um die DNA wieder aufzuhängen und Luftblasen abzuleiten. Nachdem Sie die Platte über Nacht inkubiert haben, wiederholen Sie die Zentrifugation, um Luftblasen abzuleiten.
Legen Sie dann die Platte in das gekühlte Speicherdock. Schließen Sie die qPCR-Maschine an einen Mikroplattenhandler an. Dann programmieren Sie den Mikroplattenhandler entsprechend dem Textprotokoll.
Sobald der Lauf abgeschlossen ist, lassen Sie den Roboter die Platte von der qPCR-Maschine abholen und in das Auswurfdock legen. Öffnen Sie nach Abschluss der Verstärkung die qPCR-Software. Öffnen Sie unter der Registerkarte Navigator die gespeicherte Reaktionsexperimentdatei für eine Platte.
Öffnen Sie als Nächstes das Fenster Neue Analyse erstellen, und wählen Sie die entsprechenden Einstellungen für die 2. Derivative Max-Methode aus. Wählen Sie dann Filtercomb aus, und stellen Sie sicher, dass die für STAT6 gesammelten Daten ausgewählt sind. Wählen Sie die entsprechende Farbkompensation aus.
Klicken Sie auf Berechnen, und klicken Sie dann auf Datei speichern. Um die Daten mit der Methode Punkte anpassen zu analysieren, öffnen Sie das Fenster Neue Analyse erstellen, und wählen Sie die entsprechenden Einstellungen für die Methode Punkte anpassen aus. Wählen Sie dann die richtigen Filter und Farbkompensationen für STAT6 aus.
Legen Sie das Rauschband fest, um das Hintergrundrauschen auszuschließen. Danach öffnen Sie die Registerkarte Analyse, und legen Sie die Anpassungspunkte auf drei fest, und wählen Sie Punkte anpassen aus. Speichern Sie Änderungen und wiederholen Sie die Schritte mit den entsprechenden Einstellungen für Fit Point und 2nd Derivative Analysis für die KIR-Gene.
Öffnen Sie die Registerkarte Navigator in der qPCR-Software, und wählen Sie Ergebnisse Batch-Export aus. Öffnen Sie dann den Ordner mit den Experimentdateien, und übertragen Sie sie auf die rechte Seite des Fensters. Klicken Sie auf Weiter, und wählen Sie den Namen und Speicherort der Exportdatei aus.
Wählen Sie danach den Analysetyp des Interesses aus, und klicken Sie auf Weiter. Stellen Sie sicher, dass der Name der Datei, der Exportordner und der Analysetyp korrekt sind, bevor Sie auf Weiter klicken, um den Exportvorgang zu starten. Wenn sich der Exportstatus in OK ändert, wird der Bildschirm automatisch zum nächsten Schritt verschoben.
Stellen Sie sicher, dass alle ausgewählten Dateien erfolgreich exportiert wurden, und klicken Sie auf Fertig. Verwenden Sie dann die Skripte im Textprotokoll, um die exportierten Platten in einzelne Reaktionen aufzuteilen und die Dateien in eine Software zu konvertieren, die durch die Kopiernummernanalysesoftware lesbar ist. Öffnen Sie anschließend die Kopiernummernanalysesoftware, und wählen Sie PCR-Ergebnisdatei in Echtzeit importieren aus, um die von den Skripts erstellten Textdateien zu laden.
Wählen Sie schließlich Analysieren aus, und führen Sie die Analyse durch, indem Sie die häufigste Beispielkopienummer auswählen. In diesem Protokoll wurde die halbautomatische Typisierung (qKAT) verwendet, um Zahlentyp KIR-Gene zu kopieren. Die häufigste Kopiernummer für KIR2DL4 war zwei Kopien, während die häufigste Kopiernummer für KIR3DS1 Null war.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es äußerst wichtig, sicherzustellen, dass die DNA genau quantifiziert wird, alle Schritte auf Eis durchzuführen und sicherzustellen, dass die Reagenzien vom Licht bedeckt sind. Es ist auch wichtig, die Rohdaten für Proben, die nicht den bekannten LD-Regeln für KIR-Gene entsprechen, gründlich zu überprüfen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. das Vorhandensein von Fusionsgenen oder die Identifizierung neuartiger Allele.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Methode den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immungenetik, um die Rolle von KIR in der NK-Zellbiologie, Krankheitsresistenz und menschlicher Fortpflanzung zu erforschen.
