Questo metodo può rispondere a domande chiave sulla genetica dei recettori cellulari NK come la diversità dell'aplotipo e su come questo si relaziona con la malattia. La dimostrazione visiva di questo metodo aiuterà a impostare il protocollo in laboratorio, incluso il processo di automazione e l'analisi dei dati. I principali vantaggi di questa tecnica sono che, a differenza dei metodi convenzionali, qKAT, che sta per tipizzazione automatica KIR quantitativa, è ad alta produttività e fornisce il numero di copia genica.
qKAT può fornire informazioni sull'associazione delle malattie. Le implicazioni di questa tecnica possono essere utili per la terapia per infezioni virali come HIV ed epatite C, nel cancro, nel trapianto di cellule staminali e nei disturbi della gravidanza. qKAT può anche essere applicato nello studio della genetica delle popolazioni, nonché nell'esplorazione dell'espressione e delle interazioni funzionali tra molecole KIR e HLA.
qKAT consiste di 10 reazioni multiplex che prendono specificamente di mira gli esoni dei due geni KIR e un gene di riferimento. In questo protocollo, i primer specifici sono progettati per rilevare gli alleli del gene dato e i risultati della PCR in ampliconi brevi. Successivamente, le sonde di idrolisi specifiche a doppia etichetta vengono utilizzate per monitorare l'amplificazione PCR in tempo reale.
L'analisi del numero di copia utilizza la quantificazione relativa dei geni KIR bersaglio in un gene di riferimento. qKAT è progettato e impostato per essere una tecnica ad alta produttività. Quindi, ogni reazione può essere eseguita su poco meno di 1.000 campioni.
I seguenti passaggi mostrano i passaggi coinvolti nella preparazione e nella placcatura da ogni piastra di DNA a 96 porvi. Per iniziare, dopo aver quantificato il DNA, diluire il DNA in una piastra profonda 96 pozzi. Includere almeno un esempio di controllo con un numero di copia noto e un controllo non modello.
Centrifugare la piastra a 450 g per due minuti. Quindi, distribuire ogni campione in quadruplicate in piastre qPCR da 384 pozzi. Dopo questo, asciugare all'aria il DNA in un'area pulita a temperatura ambiente per 24 ore.
Per impostare una reazione qKAT per piastre da 10 384 pozzi, in primo luogo, scongelare le aliquote qPCR buffer, primer e probe a quattro gradi Celsius. Preparare il mix master sul ghiaccio secondo il protocollo di testo. Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire il mix principale in modo uniforme su una piastra a pozzo profondo 96 po '.
Distribuire 9,5 microlitri del master mescolare in ogni pozzo della piastra con i campioni di gDNA essiccati. Dopo questo, sigillare il piatto con un foglio e conservarlo immediatamente a quattro gradi Celsius. Ricordarsi di eseguire un lavaggio corto dell'acqua per pulire gli aghi del sistema di movimentazione dei liquidi se si eroga la miscela principale su più di una piastra di DNA da 384 porsi.
Centrifugare la piastra con i campioni di gDNA a 450 g per tre minuti. Quindi, incubare la piastra a 4 gradi Celsius per rimescolare il DNA e dissipare eventuali bolle d'aria. Dopo aver incubato la piastra durante la notte, ripetere la centrifugazione per dissipare eventuali bolle d'aria.
Quindi, posizionare la piastra nel dock di stoccaggio raffreddato. Collegare la macchina qPCR a un gestore di micropiatte. Quindi, programmare il gestore di micropiatte in base al protocollo di testo.
Una volta completata la corsa, fare in modo che il robot riscuota la piastra dalla macchina qPCR e la posizionare nel dock degli scarti. Dopo aver completato l'amplificazione, aprire il software qPCR. Nella scheda Navigatore aprire il file dell'esperimento di reazione salvato per una piastra.
Aprire quindi la finestra Crea nuova analisi e selezionare le impostazioni appropriate per il secondo metodo Derivative Max. Quindi selezionare Filtro pettine e assicurarsi che i dati raccolti per STAT6 siano selezionati. Selezionare la compensazione del colore appropriata.
Fare clic su Calcola e quindi su Salva file. Per analizzare i dati con il metodo Fit Points, aprite la finestra Crea nuova analisi e selezionate le impostazioni appropriate per il metodo Fit Points. Selezionare quindi i filtri e le compensazioni di colore corretti per STAT6.
Impostare la banda di rumore per escludere il rumore di fondo. Successivamente, aprite la scheda Analisi e impostate i punti di adattamento su tre e selezionate Mostra punti di adattamento. Salvare le modifiche e ripetere i passaggi con le impostazioni appropriate per l'analisi Fit Point e 2nd Derivative per i geni KIR.
Aprire la scheda Navigatore nel software qPCR e selezionare Esporta batch risultati. Quindi, aprire la cartella contenente i file dell'esperimento e trasferirli sul lato destro della finestra. Fare clic su Avanti e selezionare il nome e il percorso del file di esportazione.
Successivamente, selezionare il tipo di interesse di analisi e fare clic su Avanti. Verificare che il nome del file, la cartella di esportazione e il tipo di analisi siano corretti prima di fare clic su Avanti per avviare il processo di esportazione. Quando lo stato di esportazione passa a OK, lo schermo passa automaticamente al passaggio successivo.
Assicurate che tutti i file selezionati siano stati esportati correttamente e fate clic su Fatto (Done). Quindi utilizzare gli script nel protocollo di testo per dividere le piastre esportate in singole reazioni e per convertire i file in un software leggibile dal software di analisi del numero di copia. Aprire quindi il software di analisi dei numeri di copia e selezionare Importa file di risultati PCR in tempo reale per caricare i file di testo creati dagli script.
Infine, selezionare Analizza e condurre l'analisi selezionando Il numero di copia di esempio più frequente. In questo protocollo, la tipizzazione semi-automatizzata, o qKAT, è stata usata per copiare i geni kir di tipo numerico. Il numero di copia più frequente per KIR2DL4 era di due copie, mentre il numero di copia più frequente per KIR3DS1 era zero.
Durante il tentativo di questa procedura, è estremamente importante assicurarsi che il DNA sia quantificato con precisione, condurre tutti i passaggi sul ghiaccio e assicurarsi che i reagenti siano coperti dalla luce. È anche importante eseguire controlli approfonditi sui dati grezzi per campioni non conformi alle regole LD note per i geni KIR. Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento possono essere eseguiti al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio la presenza di geni di fusione o l'identificazione di nuovi alleli.
Dopo il suo sviluppo, questo metodo ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunogenetica per esplorare il ruolo di KIR nella biologia cellulare NK, nella resistenza alle malattie e nella riproduzione umana.
