이 방법은 haplotype 다양성과 같은 NK 세포 수용체 유전학에 대한 주요 질문에 대답 할 수 있으며 이것이 질병과 어떻게 관련이 있는지. 이 방법의 시각적 데모는 자동화 프로세스 및 데이터 분석을 포함하여 실험실에서 프로토콜을 설정하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 방법과 달리 정량적인 KIR 자동 타이핑을 의미하는 qKAT이 높은 처리량이며 유전자 복사 번호를 제공한다는 것입니다.
qKAT은 질병 협회에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 HIV와 C형 간염과 같은 바이러스 성 감염, 암, 줄기 세포 이식 및 임신 장애와 같은 치료에 유용 할 수 있습니다. qKAT는 또한 KIR와 HLA 분자 사이 발현 그리고 기능적인 상호 작용을 탐구하는 것 뿐만 아니라 인구 유전학을 공부에서 적용될 수 있습니다.
qKAT는 2개의 KIR 유전자 및 1개의 참조 유전자의 exons를 구체적으로 표적으로 하는 10개의 멀티플렉스 반응으로 이루어져 있습니다. 이 프로토콜에서, 특정 프라이머는 주어진 유전자의 진동을 검출하도록 설계되고 PCR 결과는 짧은 앰플리톤에서 초래된다. 그 후 이중 표지된 특정 가수분해 프로브를 사용하여 PCR 증폭을 실시간으로 모니터링합니다.
복사 번호 분석은 기준 유전자에 대한 표적 KIR 유전자의 상대적 정량화를 사용합니다. qKAT은 고처리량 기술로 설계 및 설정됩니다. 따라서, 각 반응은 단지 1, 000 샘플 에서 수행 될 수있다.
다음 단계는 각 96웰 DNA 플레이트의 제조 및 도금에 관련된 단계를 보여줍니다. 먼저, DNA를 정량화 한 후, 96 잘 깊은 우물 접시에 DNA를 희석. 알려진 복사 번호와 템플릿이 아닌 컨트롤이 있는 하나 이상의 컨트롤 샘플을 포함합니다.
2 분 동안 450 gs에서 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음 각 샘플을 384웰 qPCR 플레이트로 네 배로 분배합니다. 그 후, 공기는 24 시간 동안 실온에서 깨끗한 영역에서 DNA를 건조.
10 384웰 플레이트에 대해 하나의 qKAT 반응을 설정하려면 먼저 qPCR 버퍼, 프라이머 및 프로브 알리쿼트를 섭씨 4도에서 해동합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음 멀티 채널 파이펫을 사용하여 마스터 믹스를 96웰 의 딥 웰 플레이트에 고르게 분배합니다.
말린 gDNA 샘플로 9.5 마이크로리터의 마스터 믹스를 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 그런 다음 접시를 호일로 밀봉하고 즉시 섭씨 4도에 보관하십시오. 하나 이상의 384 웰 DNA 플레이트에 마스터 믹스를 분배하는 경우 액체 처리 시스템의 바늘을 청소하기 위해 짧은 물 세척을 수행하는 것을 기억하십시오.
3 분 동안 450 gs에서 gDNA 샘플로 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음, 4섭씨에서 플레이트를 배양하여 DNA를 다시 중단하고 기포를 분산시합니다. 하룻밤 동안 접시를 배양 한 후, 모든 기포를 분산원심분리를 반복합니다.
그런 다음 냉각 된 저장 도크에 접시를 놓습니다. qPCR 기계를 마이크로플레이트 처리기에 연결합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 마이크로 플레이트 처리기를 프로그래밍합니다.
실행이 완료되면 로봇이 qPCR 기계에서 플레이트를 수집하고 폐기 도크에 배치해야합니다. 증폭을 완료한 후 qPCR 소프트웨어를 엽니다. Navigator 탭에서 플레이트에 대해 저장된 반응 실험 파일을 엽니다.
다음으로 새 분석 만들기 창을 열고 2차 파생 최대 값 메서드에 적합한 설정을 선택합니다. 그런 다음 필터 빗을 선택하고 STAT6에 대해 수집된 데이터가 선택되었는지 확인합니다. 적절한 색상 보정을 선택합니다.
계산을 클릭한 다음 파일을 저장한 다음 클릭합니다. 맞춤 점 메서드를 사용하여 데이터를 분석하려면 새 분석 창 만들기를 열고 맞춤 점 메서드에 적합한 설정을 선택합니다. 그런 다음 STAT6에 대한 올바른 필터 및 색상 보정을 선택합니다.
노이즈 밴드를 설정하여 배경 노이즈를 제외합니다. 이 후에는 분석 탭을 열고 적합 점을 세 가지로 설정하고 맞춤 점수 표시를 선택합니다. KIR 유전자에 맞는 점 및 2차 유도체 분석을 위한 적절한 설정으로 변경 사항을 저장하고 단계를 반복합니다.
qPCR 소프트웨어에서 네비게이터 탭을 열고 결과 일괄 내보내기를 선택합니다. 그런 다음 실험 파일이 포함된 폴더를 열고 창의 오른쪽으로 전송합니다. 다음을 클릭하고 내보내기 파일의 이름과 위치를 선택합니다.
이 후 관심 의 분석 유형을 선택하고 다음을 클릭합니다. 다음을 클릭하여 내보내기 프로세스를 시작하기 전에 파일 이름, 내보내기 폴더 및 분석 유형이 올바른지 확인합니다. 내보내기 상태가 확인으로 변경되면 화면이 자동으로 다음 단계로 이동합니다.
선택한 모든 파일이 성공적으로 내보내고 완료를 클릭했는지 확인합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 스크립트를 사용하여 내보낸 플레이트를 개별 반응으로 분할하고 파일을 복사 번호 분석 소프트웨어에서 읽을 수 있는 소프트웨어로 변환합니다. 그런 다음 복사 번호 분석 소프트웨어를 열고 실시간 PCR 결과 파일 가져오기를 선택하여 스크립트에서 만든 텍스트 파일을 로드합니다.
마지막으로 가장 빈번한 샘플 복사 번호를 선택하여 분석 을 선택하고 분석을 수행합니다. 이 프로토콜에서 반자동 타이핑 또는 qKAT은 숫자 유형 KIR 유전자를 복사하는 데 사용되었습니다. KIR2DL4의 가장 빈번한 복사본 번호는 두 복사본이었고 KIR3DS1의 가장 빈번한 복사본 번호는 0이었습니다.
이 절차를 시도하는 동안 DNA가 정확하게 정량화되었는지 확인하고 얼음의 모든 단계를 수행하고 시약이 빛에서 덮여 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. KIR 유전자에 대한 알려진 LD 규칙을 준수하지 않는 샘플에 대한 원시 데이터에 대한 철저한 검사를 수행하는 것도 중요합니다. 이 절차에 따라, 시퀀싱과 같은 다른 방법은 융합 유전자의 존재 또는 새로운 항제의 식별과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.
개발 후, 이 방법은 면역 유전학 분야의 연구원들이 NK 세포 생물학, 질병 내성 및 인간 생식에서 KIR의 역할을 탐구할 수있는 길을 열었습니다.
