Este método pode responder a perguntas-chave sobre a genética do receptor de células NK, como a diversidade do haplotipo e como isso se relaciona com a doença. A demonstração visual deste método ajudará a definir o protocolo em seu laboratório, incluindo o processo de automação e análise de dados. As principais vantagens dessa técnica são que, ao contrário dos métodos convencionais, o qKAT, que significa digitação automatizada kir quantitativa, é de alto rendimento e fornece número de cópia genética.
qKAT pode fornecer insights sobre associação de doenças. As implicações dessa técnica podem ser úteis para a terapia para infecções virais como HIV e hepatite C, no câncer, no transplante de células-tronco e distúrbios da gravidez. qKAT também pode ser aplicado no estudo da genética populacional, bem como na exploração da expressão e interações funcionais entre moléculas kir e HLA.
qKAT consiste de 10 reações multiplex que visam especificamente exons dos dois genes KIR e um gene de referência. Neste protocolo, primers específicos são projetados para detectar os alelos do gene dado e os resultados do PCR em amplicons curtos. Depois disso, sondas de hidrólise específicas de dupla rotulagem são usadas para monitorar a amplificação do PCR em tempo real.
A análise de números de cópia usa quantificação relativa dos genes KIR alvo para um gene de referência. qKAT é projetado e configurado para ser uma técnica de alta produtividade. Assim, cada reação pode ser realizada em pouco menos de 1.000 amostras.
As etapas a seguir mostram os passos envolvidos na preparação e revestimento de cada placa de DNA de 96 poços. Para começar, depois de quantificar o DNA, diluir o DNA em uma placa de poço de 96 poços profundos. Inclua pelo menos uma amostra de controle com um número de cópia conhecido e um controle não-modelo.
Centrifugar a placa a 450 gs por dois minutos. Em seguida, dispense cada amostra em quadruplicação em placas qPCR de 384 poços. Depois disso, o ar seca o DNA em uma área limpa à temperatura ambiente por 24 horas.
Para configurar uma reação qKAT para 10 placas de 384 poços, primeiro, descongele o buffer qPCR, primer e alíquotas de sonda a quatro graus Celsius. Prepare a mistura mestre no gelo de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, use uma pipeta multicanal para distribuir a mistura mestre uniformemente através de uma placa de 96 poços profundos.
Distribua 9,5 microliters da mistura mestre em cada poço da placa com as amostras de gDNA secas. Depois disso, sele a placa com papel alumínio e armazene-a imediatamente a quatro graus Celsius. Lembre-se de realizar uma lavagem de água curta para limpar as agulhas do sistema de manuseio líquido se dispensar a mistura mestre em mais de uma placa de DNA de 384 poços.
Centrifugar a placa com as amostras de gDNA a 450 gs por três minutos. Em seguida, incubar a placa a 4 graus Celsius para resuspensar o DNA e dissipar quaisquer bolhas de ar. Depois de incubar a placa durante a noite, repita a centrifugação para dissipar quaisquer bolhas de ar.
Em seguida, coloque a placa na doca de armazenamento refrigerado. Conecte a máquina qPCR a um manipulador de microplacão. Em seguida, programe o manipulador de microplacões de acordo com o protocolo de texto.
Uma vez que a corrida esteja completa, peça ao robô para coletar a placa da máquina qPCR e colocá-la na doca de descarte. Após concluir a amplificação, abra o software qPCR. Sob a guia Navegador, abra o arquivo de experimento de reação salvo para uma placa.
Em seguida, abra a janela Criar novas análises e selecione as configurações apropriadas para o método 2º Derivative Max. Em seguida, selecione Filter Comb e certifique-se de que os dados coletados para STAT6 sejam selecionados. Selecione a compensação de cores apropriada.
Clique em Calcular e, em seguida, clique em salvar arquivo. Para analisar os dados com o método Ajustar pontos, abra a nova janela de análise e selecione as configurações apropriadas para o método Fit Points. Em seguida, selecione os filtros corretos e compensações de cores para STAT6.
Defina a faixa de ruído para excluir o ruído de fundo. Depois disso, abra a guia Análise e defina os pontos de ajuste para três e selecione Mostrar pontos de ajuste. Salve as alterações e repita as etapas com configurações apropriadas para fit point e análise 2ª Derivada para os genes KIR.
Abra a guia Navegador no software qPCR e selecione Exportação em lote de resultados. Em seguida, abra a pasta contendo os arquivos de experimento e transfira-os para o lado direito da janela. Clique em A seguir e selecione o nome e a localização do arquivo de exportação.
Depois disso, selecione o tipo de análise de interesse e clique em Seguir. Certifique-se de que o nome do arquivo, da pasta de exportação e do tipo de análise estão corretos antes de clicar em "Próximo" para iniciar o processo de exportação. Quando o status de exportação mudar para OK, a tela passará automaticamente para a próxima etapa.
Certifique-se de que todos os arquivos selecionados foram exportados com sucesso e clique em "Feito". Em seguida, use os scripts no protocolo de texto para dividir as placas exportadas em reações individuais e converter os arquivos em um software legível pelo software de análise de números de cópia. Em seguida, abra o software de análise de números de cópia e selecione Importar arquivo de resultados pcr em tempo real para carregar os arquivos de texto criados pelos scripts.
Por fim, selecione Analisar e realizar a análise selecionando o número de cópia da amostra mais frequente. Neste protocolo, a digitação semi-automatizada, ou qKAT, foi usada para copiar genes kir tipo número. O número de cópia mais frequente para KIR2DL4 foi de duas cópias, enquanto o número de cópia mais frequente para KIR3DS1 era zero.
Ao tentar este procedimento, é extremamente importante garantir que o DNA seja quantificado com precisão, para conduzir todos os passos no gelo e para garantir que os reagentes estejam cobertos de luz. Também é importante realizar verificações minuciosas sobre os dados brutos para amostras que não estão de acordo com as regras LD conhecidas para genes KIR. Após esse procedimento, outros métodos como sequenciamento podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, por exemplo, presença de genes de fusão, ou identificação de novos alelos.
Após seu desenvolvimento, este método abriu caminho para pesquisadores do campo da imunogenética explorarem o papel do KIR na biologia celular NK, resistência a doenças e reprodução humana.
