Photoconversion lökosit ikamet ve hastalıklı durumlarda birden fazla doku sitelerinden çıkış dinamikleri içine mekanistik bir anlayış için lökosit çıkış kantitatif analizi için izlenebilir in vivo yöntemi sağlar. Burada kutanöz tümörlerden gelen lökosit takibinin faydasını gösteriyoruz. Bu titrenin diğer doku ve hastalıklara uygulanması sadece ışığı uygulama yeteneği ile sınırlıdır.
Bu tekniğin en büyük avantajı endojen in vivo iltihaplı dokulardan bir çıkış olarak bağışıklık hücre popülasyonları transfer yerine, nicelik sağlar. Iltihabı tetiklemek için, ayak ucutu yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, bir anestezi Kaede transgenik fare kulak pinna ventral tarafına, dibutil ftalat veya DBP 20 mikrolitre yönetmek için bir mikropipet kullanın. DBP'nin kurumasını sağladıktan sonra, kulağı alüminyum folyo parçasının yarıklarından geçirin ve dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde kulağı folyoya düz sabitlemek için çift taraflı bant kullanın.
Daha sonra, doğrudan 405 nanometre ışık kaynağının altında olduğunuzu konumlandırın ve 100 miliwatt güçte üç dakika boyunca fotodönüştür. Vaccinia enfeksiyonu için, bir anestezi Kaede transgenik fare nin kulak pinna üzerine PBS 10 mikrolitre vaccinia virüsü n için 6 plak oluşturan birimleri 5 kez 10 yönetmek ve pinna 25 kez dürtmek için bir mikropipet kullanın. 24 saat sonra, sadece gösterildiği gibi pinna photoconvert.
Uygun deneysel zaman noktasında, pinnae ve servikal ve inguinal lenf düğümleri hasat ve her pinna ventral ve dorsal tarafı soymak için cımbız iki çift kullanın. Daha sonra lenf düğümleri ve pinna parçaları yerleştirin, kulak içi aşağı bakacak şekilde, kollajenaz D mililitre başına 1 miligram ve kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS seyreltilmiş Dnase mililitre başına 80 birim içeren 24 kuyulu bir plaka bireysel kuyular içine. Her lenf nodu kapsülü açmak ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat plaka yerleştirmek için iki 29 gauge iğne kullanın.
Kuluçka sonunda, her dokunun tek hücre süspansiyonları elde etmek için ayrı 70 Mikron naylon hücre süzgeçleri ile sindirilmiş pinna ve lenf düğümü dokularına basın. Tümörler uygun deneysel boyuta büyüdü, tümör siteetrafında herhangi bir yeni büyümüş kürk tıraş ve alüminyum folyo bir parça kesilmiş dairesel bir delik ile tümör çekin. Tümörü 405 nanometre ışık kaynağının hemen altına yerleştirin ve 200 miliwatt güçte 5 dakika boyunca fotodönüştürün.
Fotodönüşümden 24 saat sonra, her hayvandan tümörleri ve brakiyal ve inguinal lenf düğümlerini hasat edin ve HBSS'de Kollajenaz D ve DNase içeren 24 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularında tümörleri kıymak için makas kullanın. Ayrı kuyular içine lenf düğümleri yerleştirin ve sadece gösterildiği gibi kapsül açık alay. 37 santigrat derece bir saat tümörler ve lenf düğümleri için yarım saat kuluçka sonra, her doku tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için ayrı 70 Mikron süzgeçler aracılığıyla sindirilmiş dokulara basın.
Akış sitometri sitometri ile tek hücre süspansiyonları analiz etmek için, ilk bir Kaede transgenik fare dan dalak veya kan toplamak ve amonyum klorür potasyum tampon ile kırmızı kan hücreleri lyse. Bir dönüştürülmemiş Kaede FITC ve bir dönüştürülmüş Kaede PE nüfus ve 24-iyi plaka bir kuyuda PBS bir mililitre tek renkli Kaede PE hücreleri resuspend hücreleri bölmek, sonra güç 100 miliwatt güç 405 nanometre ışık kaynağı altında 5 dakika için hücreleri fotodönüştür. Daha sonra fotoconverted Kaede PE hücreleri ve dönüştürülmemiş Kaede FITC hücreleri her floresan kanalın toplam aralığının% 70-80 fotoçarpan voltajayarlamak için kullanın.
Kaede proteinleri için gerilimler ayarlandıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre, tek florofor etiketli tazminat boncukları kullanarak diğer tüm primer antikor lekelerinin telafisi. Daha sonra, standart akış sitometrik analiz protokollerine göre akış sitometresi üzerindeki örnekleri çalıştırın. Fotodönüşüm maruziyetinden hemen sonra kulak derisinden veya servikal drenaj lenf düğümlerinden oluşan tek hücreli süspansiyonlar, ciltteki tüm CD45 pozitif lökositlerin %78 dönüşüm verimliliğini ortaya çıkarır ve drenaj lı lenf düğümlerinde dönüştürülmüş hücreler gözlenmez.
Fotodönüşümlü kulaklarda CD45 pozitif lökositlerin infiltrasyon sayısının sayısallaştırılması, menekşe ışık maruziyetinin lökosit infiltrasyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir artışa neden olduğunu ortaya koymaktadır. ANCAK CD45 pozitif lökosit infiltrasyonundaki bu artış, vaccinia virüsü gibi güçlü bir inflamatuar uyarıcının indüklediği infiltrasyona göre küçüktür. Photoconversion da Miles tsay ile ölçülen kulak pinnae vasküler geçirgenliği artırır, birlikte doku iltihabı üzerinde menekşe ışık etkileri doz optimize ederken dikkate alınması gerektiğini belirten, maruz kalma süresi ve veri yorumu.
Fotokondisyonlu hayvanlardan ayrıştırılmış tümör hücrelerinin akış sitometrik analizi, kaede FITC pozitif ten Kaede PE pozitif intratümöral CD45 pozitif hücrelerin önemli bir dönüşüm ortaya koymaktadır, lenf düğümü hücreleri drenaj ise dönüştürülmemiş kalır. CD45 pozitif lökositlerin fotodönüşüm etkinliği tümör tipleri ve boyutları arasında anlamlı olarak farklılık gösterirken, küçük melanom tümörlerinde CD45 pozitif lökositler en etkili fotodönüşümü gösterdi. Tümör hacimleri arttıkça, dönüşüm verimi yaklaşık% 50'ye düşer, melanin küçük tümörlerde sadece yaklaşık% 30 melanin üreten tümörler içinde gözlenen CD45 pozitif hücrelerin maksimum fotodönüşüm ile fotodönüşüm verimliliği üzerinde çarpıcı bir etkisi vardır, tümör hacimleri yaklaştıkça 10% düşer 400 milimetreküp.
Fotodönüşümden 24 saat sonra tümör drenaj lenf nodlarının incelenmesi, çeşitli fenotiplerin Kaede kırmızı pozitif immün hücrelerinin varlığını ortaya çıkararak fotokonjenden lökosit göçünün ortaya çıkar. Bu teknik, gelişiminden sonra, İmmünoloji alanında araştırmacıların sabit hal inkinetiğini ortaya çıkarmasını ve periferik dokuda iltihaplı lökosit cirosunu ortaya çıkarmasını istedi. Bu yordamı denerken, sadece ilgi doku fotodönüştürülerek olduğundan emin olmak önemlidir, çevreleyen doku yanlışlıkla fotodönüşüm sonuçlarınızı tehlikeye atacaktır gibi.
Bu yönteme yeni yeni bireyler, doku larının dönüştürülmesi için maruz kalma süresini ve lekositin dinamiğine bağlı olarak doku toplamadan önceki süreleri optimize etmelidirler.
