Laboratuvarım üç ve dört boyutlu tümör modellemesinde uzmanlaşmıştır. Tümör sferoid modelleri, biyoloji ve ilaç keşfi boyunca yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu deneylerden veri toplamak için mevcut protokoller pahalı, zor ve sınırlıdır.
Bu protokol kolay erişilebilir kimyasallar ve ekipmanlar gerektirmekte olup, benzer sonuçlar veren mevcut yöntemlere kıyasla çok emek yoğun değildir. Bu protokol, yeni başlayanlar için uygulanması nispeten kolay ve adımların çoğu geri dönüşümlü olduğu için küçük hatalara karşı sağlam olacak şekilde geliştirilmiştir. Bir cam şişede 0,5 gram düşük erime noktalı agaroz tartarak başlayın.
Ve 25 mililitre PBS ekleyin. Agarozu, çözeltiyi bir mikrodalgada kapak kapalıyken 30 ila 60 saniye kaynatarak ve sürekli dönerek eritin. Dokuz gram N, N, N'N'Tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin, 22 gram üre, 44 gram sakaroz, 0.1 gram Triton X-100 ve 24.9 gram deiyonize su tartın.
Çözeltiyi sürekli karıştırarak 56 santigrat derecelik bir su banyosunda ısıtın. Kristaller çözüldükten sonra, karıştırma sırasında oluşan kabarcıkların yüzeye çıkmasına izin vermek için çözeltiyi oda sıcaklığında dinlendirin. Metin el yazmasında açıklanan agaroz bindirme yöntemini kullanarak sferoidler oluşturun.
Deliği büyütmek için bir mililitrelik pipet ucunun ucunu neşter kullanarak kesin. Pipetleri kullanarak, sferoidleri kuyucuklardan aspire edin ve bunları 1,5 mililitrelik berrak bir konik tüpe aktarın. Aynı koşullardan birden fazla sferoid aynı tüpte birleştirilebilir.
Sferoidleri bir mililitre PBS'de iki kez yıkayın, daha sonra% 4 önceden ısıtılmış paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve sferoidleri 37 santigrat derecede inkübe edin. 20 dakika sonra, paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve sferoidleri bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra boyama için, bir pipet kullanarak 200 mikrolitrelik bir PCR tüpüne 15 adede kadar sferoid aktarın.
PBS'de 200 mikrolitre% 0.5 Triton X-100 kullanarak hücreleri geçirgenleştirin. PCR tüplerini 50 mililitrenin içine yerleştirin, kapaklı tüpleri vidalayın ve tüpü alüminyum folyo ile örtün ve sferoidleri oda sıcaklığında hafif ajitasyonla inkübe edin. İki saat sonra, çözeltiyi 200 mikrolitre antikor seyreltme tamponu ile değiştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Ertesi gün, 75 mikrolitre birincil antikor eklemeden önce antikor seyreltme tamponunu çıkarın ve iki buçuk gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süpernatantı çıkarın ve% 0.1 Ara ve% 0.1 Triton X-100 veya PBS-TT içeren 200 mikrolitre PBS ile sferoidleri iki kez yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında dört saat boyunca 200 mikrolitre PBS-TT ile inkübe edin.
Daha sonra, 100 mikrolitre ikincil antikor eklemeden önce PBS-TT'yi çıkarın ve iki buçuk gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süpernatantı çıkarın ve dört saat boyunca 200 mikrolitre PBS-TT ile inkübe etmeden önce PBS-TT ile iki kez yıkayın. Montaj için, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın, sabit ve lekeli sferoidleri, koşul başına bir tüpte 500 mikrolitrelik PCR tüplerine aktarın.
Çözeltiyi 200 mikrolitre% 2 sıvı agaroz jeli ile değiştirin ve hızlı dönüşte, sabit maksimum hızda, oda sıcaklığında, 30 saniye boyunca santrifüj yapın. Sferoidleri 50 mikrolitre sıvı agaroz jeli içinde aspire edin ve 24 delikli bir cam alt plakanın kuyusuna dağıtın. Jel sertleşmeden önce, sferoidleri çevreleyen jelde bir pipet ucu kullanarak ayırın ve sferoidlerin jelle kaplandığından emin olun.
Daha sonra, kuyucuk başına 500 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyerek jeli batırın ve görüntülemeden önce 24 saat boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta inkübe edin. Görüntüleme için, sferoidin gemideki montaj yüksekliği de dahil olmak üzere tüm sferoidi kapsayacak kadar uzun bir çalışma mesafesine sahip bir hedef seçin. Ekvator düzlemini tanımlamak için, XY düzleminde en büyük yüzey alanına ulaşılana kadar odağı ayarlayın ve gerekli lazer güç yüzdesi, dedektör voltajı, kazanç ve ofset ayarlarıyla görüntü oluşturun.
Üç boyutlu görüntüler için, sferoidlerin başlangıcını ve bitişini ayarlayın ve Z yoğunluğu düzeltme ayarlarını kullanarak çeşitli Z derinliklerinde uygun sinyal yoğunluğunu seçin. Bu çalışma, PBS'ye monte edilmiş sferoidlerle karşılaştırıldığında, temizlenmiş ve temizlenmemiş FUCCI insan melanom sferoidlerinin bir karşılaştırmasını göstermektedir. Temizleme çözümü, minimum boyut bozulmasıyla yüksek netlikte görüntüler sağlar.
Temizleme çözeltisi ayrıca, histolojik kesitleme olmadan sferoidlerin derinliklerinde hücresel seviye ayrıntılarının yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar. Üç boyutlu konfokal görüntüler ile 200 mikron derinlikte hücresel düzeyde detaylar elde edilebilir. Ayrıca, pimonidazol ve p27kip1 için boyanmış kriyoseksiyonlu ve temizlenmiş delik sferoid arasında bir karşılaştırma gösterilmiştir.
Pimonidazol boyaması, sferoidin hipoksik bölgesini gösterir ve p27kip1 boyaması, hücre döngüsü tutuklamasını ve DAPI nükleer boyamasını işaretler. Daha derin penetrasyon ve daha az saçılma, minimum ışık kaybı ile geliştirilmiş üç boyutlu küresel yapı gösterimine izin verir. DRAQ7 ile boyanmış FUCCI sferoidlerinin üç boyutlu gösterimi gösterilmiştir.
Takas çözeltisinin küresel boyut üzerinde minimum etkisi vardır. Kürenin çapı, sferoid ile aynı kesit alanına sahip bir küreye dayanarak tanımlanmıştır. Sferoidlerin,% 2 ile% 6 arasında bir çap kıvrım değişimi ile gösterildiği gibi, ilk altı saat içinde boyut olarak hafifçe arttığı gözlendi Buna karşılık, 24 ila 72 saat sonra, sferoidler PBS sonrası paraformaldehit fiksasyonunda karşılık gelen boyuta yaklaşık olarak eşit bir boyuta geri döndü.
Görüntüleme işleminden önce en az 24 saat beklemek, temizleme çözeltisinin sferoidler ve jel ile dengelenmesine izin vermek önemlidir. Bu protokol, uygulayıcıların çok sayıda sferoidden hızlı bir şekilde veri toplamasına izin vererek, biyoloji hakkında ayrıntılı bilgiler sağlayan ayrıntılı nicel matematiksel ve istatistiksel analizlere izin verir.
