Sınıf ve araştırma uygulamaları için harika çalışan C.elegans genomik DNA'sını çıkarmak için kolay, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Bu protokoller, PCR tabanlı uygulamalar için tek veya küçük bir C.elegance örneğinden DNA şablonlarını hızlı bir şekilde üretmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir. Solucan toplama veya mikropipetleyici kullanma deneyimi olmayan kullanıcılar, bu becerileri gerektiren adımlarla mücadele edebilir.
Yetenekli bir uygulayıcıyı izlemek ve pratik yapmak yardımcı olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan son sınıf öğrencisi olan Farhan Lakdawala olacak. Tek bir Caenorhabditis elegans solucanından DNA çıkarmak için, önce bir döngüden oluşan lizis programını 10 dakika boyunca 55 santigrat derecede, ardından bir termosiklusta üç dakika boyunca 95 santigrat derecede ayarlayın.
Lizis çözeltisini hazırlamak için, önce kitten buz üzerindeki 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünün iç duvarına 0.8 mikrolitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. Daha sonra kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.2 mikrolitre doku hazırlama çözeltisi ekleyin ve sevişerek karıştırın. DNA ekstraksiyonu için bir solucan seçimi ile, ilk olarak, diseksiyon mikroskobu altında bir L4 veya yetişkin hayvanı tanımlayın.
Bir L4 hermafrodit, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulva ile tanımlanabilir. Yetişkin bir hermafroditi tanımlamak için, uterusunda görülebilen oval embriyolara sahip olabilecek plakadaki en büyük hayvanlardan birini seçin. Daha sonra, bir platin tel çekme kullanarak, seçilen hayvanı çözeltiye aktarın.
Tüpün altındaki içeriği toplamak için, tüpü oda sıcaklığında 2000 x g'de iki ila üç saniye santrifüj edin. Ardından tüpü termosiklusçuya yerleştirin ve daha önce ayarlanmış lizis programını çalıştırın. Bu lizis programı bittikten sonra, tüpü kısaca santrifüj edin ve buz üzerine koyun.
Daha sonra kitten 0,8 mikrolitre nötralizasyon çözeltisi ekleyin ve pipetle karıştırın. Yine, tüpü oda sıcaklığında 2000 x g'de iki ila üç saniye santrifüj edin. Lisat hemen kullanılmazsa, tüpü gelecekte kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın.
Tek bir solucandan DNA çıkarmak için, ilk olarak, bir döngünün lizis programını 10 dakika boyunca 55 santigrat dereceye, ardından bir termosiklusta üç dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra, önce kitten ekstraksiyon çözeltisinin iki mikrolitresini buz üzerindeki 0.2 mililitrelik bir PCR tüpünün iç duvarına ekleyerek, ardından kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.5 mikrolitre doku hazırlama çözeltisinin eklenmesiyle lizis çözeltisini hazırlayın, ardından içeriği pipetleme ile karıştırın. L4 veya yetişkin hayvanları tanımladıktan sonra, çözeltiye yeterli sayıda hayvan aktarmak için bir platin tel toplama kullanın.
Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında 2000 x g'de iki ila üç saniye santrifüj edin, ardından tüpü termosikler içine yerleştirin ve önceden ayarlanmış lizis programını çalıştırın. Programın tamamlanmasından sonra, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra nötralizasyon çözeltisinin iki mikrolitresini kitten tüpe ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
Yine, tüpü oda sıcaklığında 2000 x g'de iki ila üç saniye santrifüj edin. Hemen kullanılmazsa, lizatı gelecekte kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Protokol tarafından ekstrakte edilen genomik DNA, bir PCR şablonu olarak başarıyla kullanılabilir, hem ticari kit hem de geleneksel proteinaz K yöntemi, 2100 baz çifti ürününün ve 500 baz çifti ürününün benzer PCR amplifikasyonu seviyelerine sahip DNA üretti.
DNA lizisi için kit yöntemi ayrıca çeşitli DNA polimeraz enzimleri için etkili PCR şablonları sağladı. Farklı seyreltmelerde bile, ticari kit tarafından tek bir hayvandan ekstrakte edilen DNA, eşdeğer verimlilikle 2100 baz çifti DNA fragmanının PCR amplifikasyonunu destekledi. Bununla birlikte, 500 baz çifti DNA fragmanının amplifikasyonu, şablon konsantrasyonuna göre değişmiştir.
Genotipi belirlemek için tek bir hayvandan veya birden fazla hayvandan PCR şablonu olarak ekstrakte edilen DNA'nın uygunluğu, bir genin ve mutasyona uğramış varyantının başarılı bir şekilde amplifikasyonu ile daha da gösterilmiştir. Bu protokol, küçük hacimli reaktiflerin pipetlenmesini içerdiğinden, tutarlılığı sağlamak için, birden fazla reaksiyon, iyi boru tekniği ve iyi kalibre edilmiş pipetler için bir ana karışım kullanın. Ayrıca, tüpün içeriğini aşağı doğru döndürmek uygun lizis sağlar.
Bu yöntem ölçeklendirilebilir, diğer aşağı akış uygulamaları için C.elegans genomik DNA'sını çıkarmak için uyarlanabilir ve diğer nematod türlerinden DNA çıkarmak için kullanılabilir. Protokolün basitliği, hızı, sağlamlığı ve düşük maliyeti göz önüne alındığında, zaman ve kaynakların sınırlı olduğu hem araştırma hem de sınıf uygulamaları için çok uygundur.
