Endometrium hormonlara yanıt olarak her ay değişen bir dokudur. Hormon dengesizliği embriyo bağlanmasını önleyebilir ve aynı zamanda kanser gibi hastalıklara neden olabilir. Protokolümüz endometrium'u yeniden inşa ediyor, böylece kadının vücudunun dışında fizyolojik bir şekilde incelenebilir.
Bu tekniğin en büyük avantajı, hormonal olarak duyarlı iki hücre tipinden oluşan 3Boyutlu bir hücre yapısı sağlamasıdır, epitel ve stroma hücreleri özellikle vücutta yaptıkları gibi organize ve davranışta bulunurlar. Organoidler doku davranışını daha iyi taklit edebildiklerinden, sonunda farklı ilaçları test etmek için kullanılabilirler. Endometrial organoidler kanser için şu anda bilinen risk faktörlerinin doğrudan etkilerini incelemek için kullanılabilir, obezite ve polikistik over sendromu da dahil olmak üzere.
Organoidlerimiz iki hücre tipi arasındaki parakrin eylemlerin önemini vurgularlar. Yeterli miktarda dokuyla başlamak önemlidir. Epitel ve stromal hücrelerin doğru yoğunluğu elde etmek zor olabilir.
Ayrıca, organoidler oldukça küçük ve IHC boyama ile görselleştirmek zor olabilir. Bu yordamın görselleştirilmesi önemlidir, çünkü gördükten sonra anlaşılması çok daha kolay olan bazı adımlar vardır. Bu rahim doğru doku tabakası alma, birleştirmek için hücrelerin doğru yoğunluğu nu elde ve agarose kalıpları tohumlama içerir.
Hücre izolasyonuna başlamadan önce, organoidleri barındırmak için üreticinin talimatlarına göre %1,5 agarose mikro kalıpları atar ve dengeler. Bir biyogüvenlik kabininde, 37 santigrat derecede bir enzim çözeltisi hazırlamak için aseptik teknikler kullanın ve 15 mililitrelik konik tüpe 0,2 mikrometreşon filtre kullanarak çözeltiyi steril filtreleyin. Neşter kullanarak rahim biyopsilerinden endometrium kazıyın ve dokuyu çok küçük parçalara ayırın.
Taze kıyılmış dokuyu enzim çözeltisini içeren 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin. Kapağı kapatın ve kontaminasyonu önlemek için bir balmumu filmi ile tüpün üst sarın. Tüpü 37 derecede su banyosuna veya kuvöze yerleştirin.
Bundan sonra, 50 mililitrelik konik bir tüp üzerinde 20 mikron hücreli süzgeç üstüne 100 mikron hücreli süzgeç yığını. Çözümü iki süzgeç arasından filtreleyin. HBSS ile 15 mililitrelik konik tüp durulayın ve tüm hücrelerin toplanması sağlamak için süzgeç aracılığıyla bu yıkama koymak.
Daha sonra, yeni bir 50 mililitrekonik tüp üzerine 20 mikron hücreli süzgeç ters ve organoid medya 20 mililitre ile süzgeç kapalı epitel hücreleri yıkayın 1% penisilin ve streptomisin ile takviye. Konik tüpleri 500 G'de beş dakika santrifüj edin. Toplanan stromal hücreler için, supernatant çıkarın ve kırmızı kan hücresi lisis tampon 10 mililitre pelet resuspend.
37 derecede 10-15 dakika kuluçkaya yat. Bu hücreleri 500 G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve organoid medya 200 ila 300 mikrolitre ile pelet resuspend.
Toplanan epitel hücreleri için, supernatant kaldırmak ve organoid medya 100 mikrolitre pelet resuspend. %1.5 agarose kalıpları dengeledikten sonra, agarose kalıplarının dışındaki organoid ortamı çıkarın ve doku kültür plakasını yatırın, böylece agarose yemeklerinin hücre tohumlama odasından orta da dikkatlice çıkarılabilir. Epitel ve stromal hücre süspansiyonlarını mikroskop altında görüntüleyin ve süspansiyonlara daha fazla organoid ortam ekleyin, böylece süspansiyonun kabaca yoğunlukta eşit olmasını sağlayarak bir seferde sadece 100 mikrolitre eklemeyi unutmayın.
Sonra hacim olarak epitel hücrelerinin üç bölümden stromal hücrelerin bir kısmını birleştirin. Pipet 50 mikrolitre kombine hücre süspansiyonu agarose kalıbının hücre tohumlama odasına. Agarose kalıpları hücrelerle doldurulduktan sonra, 24 kuyulu plakanın kuyularına 400 mikrolitre taze organoid ortam ekleyin.
%5 karbondioksit ile 37 derecede kuluçka, organoid medya 500 mikrolitre ile her iki günde bir orta değiştirmek için emin olun. Yedi gün sonra, epitel ve stromal hücrelerin örgütlenmesini teşvik etmek için 0.1 nanomolar estradiol ve 0.8 nanomolar testosteron ile desteklenen bir orta değiştirin. İlk olarak, kaynatılarak PBS%1.5 agarose eritin.
Sıcak su bir kabı içine sıvı agarose yerleştirin ve yaklaşık 50 santigrat dereceye soğumasını bekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka yatırın ve dikkatle agarose kalıp dışından orta pipet. Daha sonra organoidleri bozmamak için agarose kalıbının içinden ortayı dikkatlice çıkarın.
Dikkatlice 70 ve 75 mikrolitre sıcak, 1.5% agarose çanak odasına agarose ekleyin, organoidler rahatsız etmemeye dikkat. Plaka dört santigrat derecede beş dakika soğumasını bekleyin. Bundan sonra, 24-iyi plaka her kuyuiçine% 4 paraformaldehit ekleyin ve dört santigrat derece bir gecede tüm mühürlü agarose kalıp düzeltmek.
Ertesi gün, parafin gömme işlemi için hazır olana kadar plakayı dört santigrat derecede %70 etanolde saklayın. RNA izolasyonuna başlamak için, plakayı bir kesme mikroskobu altında görüntüleyin. Tabağı yatırın ve agarose kalıbının odasından orta yı dikkatlice pipetle dışarı atın.
Zorla pipet taze organoid orta doğrudan agarose kalıp içine böylece organoidler mikrowells dışarı atılır, çok fazla kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olmak. Aynı ortamı kullanarak bu güçlü pipetleme işlemini bir kez tekrarlayın. Bundan sonra, organoidler içeren tüm orta toplamak.
Organoidleri toplamak için 500 G'de santrifüj edin ve RNA ekstraksiyonuna devam edin. Bu çalışmada, endometriumun epitel ve stromal hücrelerinden oluşan insan endometriyal organoidleri ekzojen iskele malzemeleri kullanılmadan üretilmiştir. Histolojik işlemler için, endometriyal organoidleri içeren agarose kalıpları agarose ile kapatılır, ardından bir gecede %4 paraformaldehit ile fiksasyon yapılır.
Bu kalıplar histoloji, immünoresans veya immünohistokimya için standart parafin gömme ve lekeli olarak işlenir. Eozin boyama hematoksilin hücre dışında ve merkezinde hücreleri astar tek bir tabaka ile küresel benzeri bir yapı ortaya koymaktadır. Endometrial, epitel ve stromal hücreler için hücrespesifik belirteçler merkezde stromal hücreler ile organoid çevreleyen epitel hücreleri ortaya.
Endometrial fizyolojinin belirteçleri endometrial organoidlerin doğal dokunun bazı özelliklerini koruduğunu doğrulamaktadır. Kollajen mavisi ve hücreleri kırmızı lekeler üç krom boyama, stromal hücrelerin yaşadığı merkezi içinde kollajen varlığını gösterir, aktif üretim ve stromal hücreler tarafından kollajen salgılanması gösteren yerli doku benzer. Buna ek olarak, immünohistokimyasal boyama östrojen reseptörlerinin varlığını ortaya koymaktadır, androjen reseptörleri, ve progesteron reseptörleri hem epitel hem de stromal hücrelerde.
Hücreleri yoğun bir şekilde kaplamak önemlidir, böylece akıntı deneyleri için yeterli organoidimiz olur. Bu biraz pratik alacak. Endometrial organoidler farklı koşullar altında kültürlenebilir ve daha sonra protein ekspresyonunu incelemek için immünohistokimya veya immünofloresan boyama gibi deneyler için hasat edilebilir veya gen ekspresyonunu incelemek için RNA için hasat edilir.
Laboratuarımız endometriumun değişmiş hormon düzeylerine nasıl tepki verebileceğini araştırır, bu da endometrial hiperplazi ve kansere yol açabilir. Biz hormonların uzun vadeli tedaviler için bu organoidler kullanabilirsiniz ve polikistik over sendromu bulunan aşırı testosteron gibi patolojik koşullar eklemek, ya da obezite kaynaklı endometrial değişiklikleri incelemek için adipositlerden sinyalleri. İnsan dokuları biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir ve uygun önlemlerin alınması önemlidir.
