Bu pnömatik olarak aktive mikroakışkan sıkıştırma cihazı büyüme plaka kondrositlerinin 3Boyutlu hidrojel kültürlerinde mekanobiyoloji yi incelemek için kullanılabilir. Mikroakışkan cihaz maliyet ve zaman açısından etkilidir, çünkü aynı anda küçük hacimlerde numuneler üzerinde sıkıştırmanın birden fazla büyüklüğünü üretebilir ve cihazla birlikte çeşitli mikroskobik görüntülemeler uygulanabilir. Yöntemimiz diğer hücre tiplerinin mekanobiyolojisi çalışmasına da uygulanabilir.
Mikrokanal tabakasını kurmak için, ilk olarak 10 prepolimerlik ağırlık oranıyla pdms'yi beş dakika boyunca bir kür leme maddesine karıştırın. Sonraki yerde bir köpük ped üzerinde kalıp ve ana kalıp içine karışımı dökün. PDMS'yi 30 dakika boyunca vakum odasında degas edin ve gazdan arındırılmış PDMS'yi bir parça şeffaflık filmi ile sandviçleyin.
Sıkıştırılmış montaj cam plaka, köpük pedleri ve pleksiglas plakalar ile. PDMS'yi 6 saat boyunca 80 santigrat derecede tedavi edin ve PDMS katmanını ve saydamlık filmini sandviç yapıdan izole edin. PDMS'nin yüzeylerini ve plazma temizleyicisi ile temiz cam plakayı bir dakika boyunca etkinleştirin ve PDMS'yi 80 derecelik santigrat fırındaki cam plakaya 30 dakika yapıştırın.
Sonra şeffaflık filmini kaldırın. İnce PDMS membranının hazırlanması için, 60 mikrometre kalınlığında bir PDMS tabakası elde etmek için dakikada 1.000 dönüşte bir saydamlık filminde spin kat unred PDMS. Cam plaka üzerindeki mikrokanal PDMS tabakasını ve ince PDMS tabakasını bir dakika lığına etkinleştirmek için plazma temizleyicisini kullanmadan önce 80 derece lik spin kaplı PDMS'yi 20 ila 30 dakika boyunca kısmen iyileştirin.
Daha sonra ince PDMS membran tabakasını mikrokanal PDMS katmanına bağlayın ve katmanları bir gecede 80 derecelik santigrat fırına yerleştirin. Boru bloğu hazırlama için, metal tüpleri bir petri kabının üzerine dikey olarak yerleştirin ve tüplerin yaklaşık 3/4'ü batırılıncaya kadar yavaşça kabın içine damlatılmış PDMS dökün. PDMS'yi bir vakum odasında 30 dakika gazdan çıkardıktan sonra, PDMS'yi 60 derecede 6saatten fazla bir süre fırında tedavi edin.
Kürleme işleminin sonunda, bir tüp içeren bir PDMS bloğu parçasını kesin ve giriş için ince PDMS katmanında bir delik aç. PLAZMA temizleyici ile PDMS bloğunu ve ince PDMS tabakasını etkinleştirin. Bir dakika sonra, PDMS bloğunu ince PDMS tabakasının giriş deliğine takın ve tüm aktüasyon ünitesini bir gecede 80 derece fırında yerleştirin.
Agarose jel kalıp hazırlama için, deiyonize suda% 5 agarose ve 200 milimolar kalsiyum klorür karıştırın ve kaynayana kadar agarose jel çözeltisi ısıtın. Bir alüminyum kalıp içine haşlanmış agarose jel çözeltisi dökün ve cam plaka ile kalıp sandviç. Beş dakika sonra, alüminyum kalıp katılaşmış agarose jel çıkarın.
Aminosilanized cam plaka üzerine aljinat-kondrosit çözeltisi Plaka 150 mikrolitre ve üç dakika agarose jel kalıp ile çözelti kapağı. Kuluçka sonunda, aşırı aljinat jel çözeltisi kaldırmak ve plaka dan agarose jel kalıp kaldırmak için bir jilet kullanın. Sonra bir dakika için deiyonize suda 50 milimolar kalsiyum klorür ve 140 milimoler sodyum klorür içeren çapraz bağlama çözeltisi içine aljinat-kondrosit yapıları yerleştirin.
Cihazı monte etmek için, aktüasyon ünitesinin ince PDMS tabakasının dört köşesine dört bir milimetre kalınlığında PDMS boşluk bulun. İnce PDMS tabakasının hava odalarını 700 mikrolitre kondrosit kültür ortamı ile kapatın. Stereo mikrosope kullanarak, aljinat-kondrosit yapısını ince PDMS tabakasına yerleştirin, yapıları hava odalarıyla hizaya getirmeye özen takın ve cihazı 3D baskılı kelepçelerle kıskaca alın.
Cihazın harekete geçirmek için, bir hava pompasıçıkış bir solenoid vana girişi ile bağlamak için silikon boru bir parça kullanın. Solenoid valfin çıkışını monte edilmiş cihazın girişine bağlamak için ek bir boru parçası kullanın. Solenoid valfi bir fonksiyon jeneratörü ile bağlayın ve solenoid valf işlemek için fonksiyon jeneratörü tarafından oluşturulan bir hertz kare dalga kullanın.
Daha sonra cihazı pnömatik olarak harekete geçirmek için hava pompasını açın. Mikroakışkan kondrosit sıkıştırma cihazı silindirik aljinat-kondrosit yapılar beş beş dizi içerir ve bu yapılar sıkıştırma beş farklı büyüklükleri ile sıkıştırılabilir. Bu örnekte, jel sütunu en büyük PDMS balonu tarafından %33,8 oranında yüksekliğinde sıkıştırılmış ve jel yapılarının kompresif gerilimi 0,2 milimetrelik artış başına yaklaşık %5 ve PDMS balon çapı artmıştır.
Kondrositlerin kompresif deformasyonu, jel yapı merkezinin yakınındaki 613'e 613'te 40-55 mikrometre hacmindeki hücrelerin görüntülenmesiyle belirlendi. Burada en büyük PDMS balonu tarafından %16 sıkıştırılmış bir kondrosit görüntüsü gösterilmiştir. Bu grafikte ölçülen hücre sıkıştırma gerilim değerlerinin dağılımı gözlemlenebilir.
Bu analizde, hücreler daha büyük PDMS balonları tarafından genel olarak sıkıştırıldı. Birlikte ele alındığında, bu veriler aljinat jel ve kondrosit sıkıştırma miktarları 14 kilopascals sabit bir basınç altında PDMS balon çapı tarafından kontrol edilir öneririz. Cihaz performansının tekrarlanabilirliğini sağlamak için, sabit kalınlık ve elastikiyete sahip ince bir PDMS membran oluşturmak çok önemlidir.
Bu prosedürü takiben, immünoresans ve in situ hibridizasyon gibi çeşitli biyolojik tahliller yapılabilir. Bu teknik kullanılarak, büyüme plaka veya eklem kondrositlerinde mekanotransdüksiyon ile ilgili birçok soru cevaplanabilir.
