Este dispositivo de compresión microfluídica activado neumáticamente se puede utilizar para estudiar la mecanobiología en cultivos de hidrogel 3D de condrocitos de placas de crecimiento. El dispositivo microfluídico es rentable y eficaz en el tiempo, ya que puede generar simultáneamente múltiples magnitudes de una compresión en pequeños volúmenes de muestras, y se pueden aplicar varias imágenes microscópicas con el dispositivo. Nuestro método también se puede aplicar al estudio de la mecanobiología de otros tipos de células.
Para configurar la capa de microcanal, primero mezcle PDMS con una relación de peso de 10 prepolímeros a un agente de curado durante cinco minutos. A continuación, coloque el molde en una almohadilla de espuma y vierta la mezcla en el molde maestro. Desgasar el PDMS en una cámara de vacío durante 30 minutos y emparedar los PDMS desgastados con una pieza de película de transparencia.
Sujete el conjunto emparedado con la placa de vidrio, las almohadillas de espuma y las placas de plexiglás. Cure los PDMS a 80 grados centígrados durante seis horas y aísle la capa PDMS y la película de transparencia de la estructura intercalada. Active las superficies del PDMS y una placa de vidrio limpia con el limpiador de plasma durante un minuto antes de unir el PDMS a la placa de vidrio en el horno Celsius de 80 grados durante 30 minutos.
A continuación, quite la película de transparencia. Para la preparación de la membrana delgada PDMS, gire la capa PDMS sin curar en una película de transparencia a 1.000 rotaciones por minuto durante un minuto para obtener una capa PDMS de 60 micrómetros de espesor. Curar parcialmente los PDMS recubiertos de centrifugado a 80 grados Celsius durante 20 a 30 minutos antes de usar el limpiador de plasma para activar la capa PDMS de microcanal en la placa de vidrio y la capa delgada PDMS durante un minuto.
A continuación, une la fina capa de membrana PDMS a la capa PDMS de microcanal y coloca las capas en el horno Celsius de 80 grados durante la noche. Para la preparación de bloques de tubos, coloque los tubos metálicos verticalmente sobre una placa de petri y vierta suavemente PDMS no curados en el plato hasta que aproximadamente 3/4 de los tubos estén sumergidos. Después de desgasar el PDMS en una cámara de vacío durante 30 minutos, cure el PDMS en el horno a 60 grados centígrados durante más de seis horas.
Al final del proceso de curado, corte un fragmento de bloque PDMS que contenga un tubo y realice un agujero en la capa delgada de PDMS para la entrada. Active el bloque PDMS y la capa delgada PDMS con el limpiador de plasma. Después de un minuto, conecte el bloque PDMS al orificio de entrada de la capa delgada PDMS y coloque toda la unidad de accionamiento en el horno a 80 grados centígrados durante la noche.
Para la preparación del moho de gel de agarosa, mezcle el 5% de la agarosa y el cloruro de calcio 200 mililitros en agua desionizada y caliente la solución de gel de agarosa hasta que hierva. Vierta la solución de gel de agarosa hervida en un molde de aluminio y emparece el molde con la placa de vidrio. Después de cinco minutos, retire el gel de agarosa solidificado del molde de aluminio.
Placa 150 microlitros de solución de alginato-condrocitos sobre la placa de vidrio aminosilizado y cubrir la solución con moho de gel de agarosa durante tres minutos. Al final de la incubación, utilice una cuchilla de afeitar para eliminar la solución excesiva de gel de alginato y retire el molde de gel de agarosa de la placa. A continuación, coloque las construcciones de condrocitos de alginato en una solución de reticulación que contenga cloruro de calcio de 50 milimolar y cloruro de sodio de 140 milimolar en agua desionizada durante un minuto.
Para ensamblar el dispositivo, localice cuatro espaciadores PDMS de un milímetro de grosor en las cuatro esquinas de la capa delgada PDMS de la unidad de accionamiento. Cubra las cámaras de aire de la fina capa PDMS con 700 microlitros de medio de cultivo de condrocitos. Usando un microsope estéreo, coloque la construcción de condrocitos de alginato en la capa delgada PDMS, teniendo cuidado de alinear las construcciones con las cámaras de aire, y sujete el dispositivo con abrazaderas impresas en 3D.
Para la accionamiento del dispositivo, utilice una pieza de tubo de silicio para conectar la salida de una bomba de aire con la entrada de una válvula solenoide. Utilice una pieza adicional de tubo para conectar la salida de la válvula solenoide con la entrada del dispositivo montado. Conecte la válvula solenoide con un generador de funciones y utilice una onda cuadrada de hercio generada por el generador de funciones para manipular la válvula solenoide.
A continuación, encienda la bomba de aire para accionar el dispositivo neumáticamente. El dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos contiene cinco por cinco matrices de construcciones cilíndricas de alginato-condrocitos y estas construcciones se pueden comprimir con cinco magnitudes diferentes de compresión. En este ejemplo, la columna de gel se comprimió un 33,8% de altura por el globo PDMS más grande y la cepa compresiva resultante de las construcciones de gel aumentó aproximadamente un 5% por incremento de 0,2 milímetros y el diámetro del globo PDMS.
La deformación compresiva de los condrocitos se determinó mediante la toma de imágenes de las células en un volumen de 613 por 613 por 40 a 55 micrómetros cerca del centro de construcción del gel. Aquí se muestra una imagen de un condrocitos que fue comprimido en un 16% por el globo PDMS más grande. En este gráfico, se puede observar la distribución de los valores de deformación unitaria de compresión celular medidos.
En este análisis, las celdas se comprimieron más en general mediante globos PDMS más grandes. En conjunto, estos datos sugieren que las cantidades de gel de alginato y compresión de condrocitos están controladas por el diámetro de los globos PDMS bajo una presión constante de 14 kilopascales. Para garantizar la repetibilidad del rendimiento del dispositivo, es crucial crear una membrana DELGADA PDMS con un espesor y elasticidad constantes.
Después de este procedimiento, se pueden realizar varios ensayos biológicos, como la inmunofluorescencia y la hibridación in situ. Usando esta técnica, muchas preguntas sobre la mecanotransducción en placa de crecimiento o condrocitos articulares pueden ser respondidas.
