Questo dispositivo di compressione microfluidico attivato pneumaticamente può essere utilizzato per studiare la meccanobiologia nelle colture di idrogel 3D dei condrociti delle piastre di crescita. Il dispositivo microfluidico è economico ed economico perché può generare contemporaneamente più grandezze di compressione su piccoli volumi di campioni e varie immagini microscopiche possono essere applicate con il dispositivo. Il nostro metodo può essere applicato anche allo studio della meccanobiologia di altri tipi di cellule.
Per impostare lo strato di microcanale, mescolare prima PDMS con un rapporto di peso di 10 prepolimeri con un agente di polimerizzazione per cinque minuti. Quindi posizionare lo stampo su un cuscinetto di schiuma e versare la miscela nello stampo principale. Degasa il PDMS in una camera a vuoto per 30 minuti e incastri il PDMS degassato con un pezzo di pellicola trasparente.
Bloccare l'assieme inserito con la piastra di vetro, i cuscinetti in schiuma e le piastre in plexiglass. Curare il PDMS a 80 gradi Celsius per sei ore e isolare lo strato PDMS e il film di trasparenza dalla struttura sandwich. Attivare le superfici del PDMS e una piastra di vetro pulita con il detergente al plasma per un minuto prima di legare il PDMS sulla piastra di vetro nel forno Celsius di 80 gradi per 30 minuti.
Quindi rimuovere il film di trasparenza. Per la preparazione della sottile membrana PDMS, spin coat PDMS non curato su un film di trasparenza a 1.000 rotazioni al minuto per un minuto per ottenere uno strato PDMS spesso 60 micrometri. Polimerizza parzialmente il PDMS rivestito di spin a 80 gradi Celsius per 20-30 minuti prima di utilizzare il detergente al plasma per attivare lo strato PDMS a microcanale sulla piastra di vetro e il sottile strato PDMS per un minuto.
Quindi legare il sottile strato di membrana PDMS sullo strato PDMS a microcanale e posizionare gli strati nel forno Celsius di 80 gradi durante la notte. Per la preparazione del blocco di tubi, posizionare i tubi metallici verticalmente su una piastra di Petri e versare delicatamente il PDMS non curato nella piastra fino a quando circa 3/4 dei tubi non sono sommersi. Dopo aver degassato il PDMS in una camera a vuoto per 30 minuti, curare il PDMS nel forno a 60 gradi Celsius per più di sei ore.
Al termine del processo di polimerizzazione, tagliare un pezzo di blocco PDMS contenente un tubo e perforare un foro nel sottile strato PDMS per l'ingresso. Attivare il blocco PDMS e il sottile strato PDMS con il pulitore al plasma. Dopo un minuto, attaccare il blocco PDMS al foro di ingresso del sottile strato PDMS e posizionare l'intera unità di azionamento nel forno a 80 gradi Celsius durante la notte.
Per la preparazione dello stampo in gel di agarosio, mescolare il 5%agarosio e il cloruro di calcio millimolare in acqua deionizzata e riscaldare la soluzione di gel di agarosio fino all'ebollizione. Versare la soluzione di gel di agarosio bollito in uno stampo in alluminio e incastrere lo stampo con la piastra di vetro. Dopo cinque minuti, rimuovere il gel di agarosio solidificato dallo stampo in alluminio.
Piastra 150 microlitri di soluzione di alginato-condrocita sulla piastra di vetro amminosilanizzata e coprire la soluzione con stampo in gel di agarosio per tre minuti. Alla fine dell'incubazione, utilizzare una lama di rasoio per rimuovere l'eccessiva soluzione di gel di alginato e rimuovere lo stampo in gel di agarosio dalla piastra. Quindi posizionare i costrutti di alginato-condrocita in soluzione di reticolamento contenente 50 cloruro di calcio millimolare e cloruro di sodio millimolare in acqua deionizzata per un minuto.
Per assemblare il dispositivo, individuare quattro distanziale PDMS spessi un millimetro sui quattro angoli del sottile strato PDMS dell'unità di azionamento. Coprire le camere d'aria del sottile strato PDMS con 700 microlitri di mezzo di coltura di condrociti. Utilizzando un microsope stereo, posizionare il costrutto alginato-condrocita sul sottile strato PDMS, facendo attenzione ad allineare i costrutti con le camere d'aria e bloccare il dispositivo con morsetti stampati in 3D.
Per l'attuazione del dispositivo, utilizzare un pezzo di tubi di silicio per collegare l'uscita di una pompa dell'aria con l'ingresso di una valvola solenoide. Utilizzare un ulteriore pezzo di tubo per collegare l'uscita della valvola solenoide con l'ingresso del dispositivo assemblato. Collegare la valvola solenoide con un generatore di funzioni e utilizzare un'onda quadra hertz generata dal generatore di funzioni per manipolare la valvola solenoide.
Quindi accendere la pompa dell'aria per azionare il dispositivo pneumaticamente. Il dispositivo di compressione dei condrociti microfluidici contiene cinque per cinque array di costrutti cilindrici alginati-condrociti e questi costrutti possono essere compressi con cinque diverse magnitudini di compressione. In questo esempio, la colonna di gel è stata compressa del 33,8% di altezza dal palloncino PDMS più grande e il ceppo compressivo risultante dei costrutti di gel è aumentato di circa il 5% per incremento di 0,2 millimetri e il diametro del palloncino PDMS.
La deformazione compressiva dei condrociti è stata determinata imaging delle cellule in un volume di 613 da 613 per 40-55 micrometri vicino al centro di costruzione del gel. Qui viene mostrata un'immagine di un condrocita che è stato compresso del 16% dal più grande palloncino PDMS. In questo grafico, si può osservare la distribuzione dei valori di deformazione di compressione cellulare misurati.
In questa analisi, le celle sono state compresse più complessivamente da palloncini PDMS più grandi. Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che le quantità di gel alginato e compressione dei condrociti sono controllate dal diametro dei palloncini PDMS sotto una pressione costante di 14 kilopascal. Per garantire la ripetibilità delle prestazioni del dispositivo, è fondamentale creare una sottile membrana PDMS con uno spessore ed elasticità costanti.
Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti vari saggi biologici, come l'immunofluorescenza e l'ibridazione in situ. Usando questa tecnica, molte domande sulla meccanotrasduzione nella piastra di crescita o nei condrociti articolari possono essere risolte.
