Это пневматически активированное микрофлюидное компрессионное устройство может быть использовано для изучения механобиологии в 3D гидрогелевых культурах хлороцитов пластин роста. Микрофлюидное устройство является затратным и эффективным по времени, поскольку оно может одновременно генерировать несколько величин сжатия на небольших объемах образцов, и различные микроскопические изображения могут быть применены с устройством. Наш метод также может быть применен к изучению механобиологии других типов клеток.
Для настройки микроканального слоя сначала смешайте PDMS с соотношением веса 10 преполимеров к одному лечебному агенту в течение пяти минут. Затем поместите плесень на пену площадку и залить смесь в мастер-формы. Дега PDMS в вакуумной камере в течение 30 минут и бутерброд дегазации PDMS с куском прозрачности пленки.
Зажим зажатой сборки со стеклянной пластиной, пены колодки, и плексиглас пластин. Лечить PDMS при 80 градусах по Цельсию в течение шести часов и изолировать слой PDMS и прозрачность пленки из зажатой структуры. Активируйте поверхности PDMS и чистую стеклянную пластину с плазменным очистителем в течение одной минуты, прежде чем склеить PDMS на стеклянную пластину в 80-градусной печи по Цельсию в течение 30 минут.
Затем удалите пленку прозрачности. Для подготовки тонкой мембраны PDMS, спин пальто несыхоченных PDMS на прозрачность пленки на 1000 оборотов в минуту в течение одной минуты, чтобы получить 60 микрометров толщиной PDMS слой. Частично вылечить спина покрытием PDMS при 80 градусов по Цельсию в течение 20 до 30 минут, прежде чем использовать плазменный очиститель для активации микроканального слоя PDMS на стеклянной пластине и тонкий слой PDMS в течение одной минуты.
Затем свяжай тонкий мембранный слой PDMS с микроканалом PDMS и поместите слои в 80-градусную печь по Цельсию на ночь. Для приготовления тюбингового блока поместите металлические трубки вертикально на чашку Петри и аккуратно вылейте в тарелку неслыхаую PDMS до тех пор, пока около 3/4 труб не будут погружены. После дегазации PDMS в вакуумной камере в течение 30 минут, вылечить PDMS в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение более шести часов.
В конце процесса лечения, вырезать кусок блока PDMS, содержащий одну трубку и пробить отверстие в тонком слое PDMS для вставки. Активируйте блок PDMS и тонкий слой PDMS с плазменным очистителем. Через минуту прикрепите блок PDMS к отверстию в входе тонкого слоя PDMS и поместите весь актуацию в духовку при температуре 80 градусов по Цельсию на ночь.
Для приготовления агарозной геля смешайте 5%агарозу и 200 миллимолярд хлорида кальция в деионизированной воде и нагрейте раствор агарозного геля до кипения. Налейте вареный раствор геля агарозы в алюминиевую форму и сэндвич плесень со стеклянной пластиной. Через пять минут удалите затвердеть агарозный гель из алюминиевой формы.
Плита 150 микролитров раствора альгинат-хондроцитов на аминозиланизированную стеклянную пластину и накрыть раствор формой агарозного геля в течение трех минут. В конце инкубации используйте лезвие бритвы, чтобы удалить чрезмерное раствор альгината геля и удалить форму геля агарозы с тарелки. Затем поместите альгинат-хондроциты в кросс-связывающий раствор, содержащий 50 миллимолярд хлорида кальция и 140 миллимоляр хлорида натрия в деионизированной воде в течение одной минуты.
Для сборки устройства на четырех углах тонкого слоя PDMS приводного блока найдите четыре одномиллиметровых проема PDMS. Обложка воздушных камер тонкого слоя PDMS с 700 микролитров хондроцитов культуры среды. Используя стерео микросхоп, поместите конструкцию альгинат-хондроцит на тонкий слой PDMS, заботясь о выравнивать конструкции с воздушными камерами, и зажим устройства с 3D-печатных зажимов.
Для активации устройства используйте кусок кремниевой трубки для подключения розетки воздушного насоса с водой из соленоидного клапана. Используйте дополнительный кусок трубки для подключения розетки соленоидного клапана с ввесятом собранного устройства. Подключите соленоидный клапан с функциональным генератором и используйте одну квадратную волну герц, генерируемую генератором функций, чтобы манипулировать соленоидным клапаном.
Затем включите воздушный насос, чтобы включить устройство пневматически. Микрофлюидное устройство сжатия хондроцитов содержит пять на пять массивов цилиндрических конструкций альгинат-хондроцитов, и эти конструкции могут быть сжаты с пятью различными величинами сжатия. В этом примере столбец геля был сжат на 33,8% в высоту самым большим воздушным шаром PDMS, и в результате сжимаемое напряжение конструкций геля увеличилось примерно на 5% на 0,2 миллиметра и диаметр шарика PDMS.
Компрессионная деформация хондроцитов была определена путем визуализации клеток в объеме 613 на 613 на 40-55 микрометров вблизи центра конструкции геля. Здесь показано изображение хондроцита, который был сжат на 16% самым большим воздушным шаром PDMS. На этом графике можно наблюдать распределение измеренных значений штамма сжатия клеток.
В этом анализе клетки были сжаты в целом более крупными воздушными шарами PDMS. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что количество альгинатного геля и сжатия хондроцитов контролируется диаметром воздушных шаров PDMS под постоянным давлением 14 килопаскалей. Для обеспечения повторяемости работы устройства крайне важно создать тонкую мембрану PDMS с постоянной толщиной и эластичностью.
После этой процедуры могут быть проведены различные биологические анализы, такие как иммунофлуоресценция и гибридизация на месте. Используя этот метод, можно ответить на многие вопросы о механотрансдукции в пластине роста или суставных хондроцитах.
