이 공압 활성 미세 유체 압축 장치는 성장 판 연골 세포의 3D 하이드로겔 배양에서 메카노생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 미세 유체 장치는 소량의 샘플에 대한 압축의 여러 크기를 동시에 생성할 수 있기 때문에 비용과 시간 효율적이며, 다양한 현미경 이미징을 장치와 함께 적용할 수 있다. 우리의 방법은 또한 다른 세포 모형의 mechanobiology의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.
마이크로 채널 층을 설정하려면 먼저 PDMS를 10개의 프리폴리머의 중량 비와 1개의 경화제에 5분 동안 혼합합니다. 다음으로 폼 패드에 금형을 놓고 혼합물을 마스터 몰드에 붓습니다. 진공 챔버에서 PDMS를 30분 동안 분해하고 변형된 PDMS를 투명 필름조각으로 샌드위치로 만듭니다.
유리 판, 폼 패드 및 플렉시 유리 플레이트로 끼인 어셈블리를 고정합니다. 6시간 동안 PDMS를 섭씨 80도에서 치료하고 PDMS 층과 투명 필름을 끼워 진 구조로부터 분리합니다. PDMS의 표면과 플라즈마 클리너로 깨끗한 유리 판을 1분 동안 활성화한 후 PDMS를 80도 의 섭씨 오븐에서 유리 판에 30분 간 접합합니다.
그런 다음 투명 필름을 제거합니다. 얇은 PDMS 멤브레인의 준비를 위해, 60 마이크로미터 두께의 PDMS 층을 얻기 위해 1 분 동안 분당 1, 000 회전에서 투명 필름에 경화되지 않은 PDMS를 회전합니다. 플라즈마 클리너를 사용하기 전에 20~30분 동안 80°C에서 스핀 코팅 PDMS를 부분적으로 치료하여 유리 판의 마이크로채널 PDMS 층과 얇은 PDMS 층을 1분 동안 활성화한다.
그런 다음 얇은 PDMS 멤브레인 층을 마이크로 채널 PDMS 층에 결합하고 하룻밤 동안 80도 섭씨 오븐에 층을 배치합니다. 튜브 블록 준비를 위해 금속 튜브를 페트리 접시에 수직으로 놓고 경화되지 않은 PDMS를 접시에 부드럽게 붓고 약 3/4개의 튜브가 물에 잠기 때까지 접시에 부드럽게 붓습니다. 진공 챔버에서 30분 동안 PDMS를 탈퇴한 후 6시간 이상 60도의 오븐에서 PDMS를 치료합니다.
경화 과정이 끝나면, 하나의 튜브를 포함하는 PDMS 블록의 조각을 잘라 입구에 대한 얇은 PDMS 층에 구멍을 펀치. 플라즈마 클리너로 PDMS 블록과 얇은 PDMS 층을 활성화합니다. 1분 후, PDMS 블록을 얇은 PDMS 층의 입구 구멍에 부착하고 전체 작동 장치를 하룻밤 동안 80°C의 오븐에 놓습니다.
아가로즈 젤 몰드 제제를 위해 5%아가로즈와 200밀리머칼슘염화물을 탈수물에 넣고 아가로즈 젤 용액을 끓일 때까지 가열합니다. 삶은 아가로즈 젤 용액을 알루미늄 몰드에 붓고 금형을 유리 판으로 샌드위치합니다. 5분 후, 알루미늄 금형에서 고화된 아가로즈 젤을 제거합니다.
알기네이트 콘드로사이클용액 150마이크로리터를 아미노실란화 유리 판에 넣고 3분간 아가로즈 겔 몰드로 용액을 덮습니다. 인큐베이션의 끝에서, 과도한 알자네이트 젤 용액을 제거하고 플레이트에서 아가로즈 젤 몰드를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다. 그런 다음 알기네이트-콘드로세포 구조를 염화 칼슘 50개와 염화 나트륨 140개가 함유한 교차 연결 용액에 1분 동안 탈온화된 물에 넣습니다.
장치를 조립하려면 작동 장치의 얇은 PDMS 층의 네 모서리에 4 개의 1 밀리미터 두께의 PDMS 스페이서를 찾습니다. 연골세포 배양 배지의 700 마이크로리터로 얇은 PDMS 층의 공기 챔버를 덮는다. 스테레오 마이크로소페를 사용하여, 얇은 PDMS 층에 알기네이트 콘드로 세포 구조를 배치, 공기 챔버와 구조를 정렬하는 주의, 3D 인쇄 클램프로 장치를 고정.
장치의 작동을 위해 실리콘 튜브 를 사용하여 공기 펌프의 콘센트와 솔레노이드 밸브의 입구를 연결하십시오. 솔레노이드 밸브의 콘센트와 조립된 장치의 입구를 연결하려면 튜브를 추가로 사용하십시오. 솔레노이드 밸브를 기능 발생기와 연결하고 기능 발생기에서 생성된 헤르츠 사각형 파를 사용하여 솔레노이드 밸브를 조작합니다.
그런 다음 공기 펌프를 켜서 장치를 공압으로 작동시합니다. 미세 유체 연골 세포 압축 장치는 원통형 알기네이트 연골세포 구재의 5개 5개 배열을 포함하고 있으며, 이러한 구조는 5가지 압축 크기로 압축될 수 있다. 이 예에서, 겔 컬럼은 가장 큰 PDMS 풍선에 의해 높이33.8%로 압축되었고 겔 구분의 결과 압축 균주는 0.2밀리미터 증분당 약 5%의 증가와 PDMS 풍선 직경을 증가시켰다.
연골세포의 압축 변형은 겔 구조 센터 근처의 613 x 613 x 40 ~ 55 마이크로미터 부피에서 세포를 이미징하여 결정하였다. 여기서 가장 큰 PDMS 풍선에 의해 16%에 의해 압축된 연골세포의 이미지가 표시됩니다. 이 그래프에서, 측정된 세포 압축 균주 값의 분포를 관찰할 수 있다.
이 분석에서, 세포는 더 큰 PDMS 풍선에 의해 전체적으로 더 압축되었다. 종합하면, 이러한 데이터는 알기네이트 겔과 연골세포 압축의 양이 14킬로파스칼의 일정한 압력하에서 PDMS 풍선의 직경에 의해 제어된다는 것을 시사한다. 장치 성능의 반복성을 보장하기 위해 일정한 두께와 탄력을 가진 얇은 PDMS 멤브레인을 만드는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 면역 형광 및 시상 혼성화와 같은 다양한 생물학적 분석이 수행 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 성장 판 이나 관절 연골 세포에 mechanotransctionction에 대 한 많은 질문에 대답할 수 있습니다.
