Ce dispositif de compression microfluidique activé pneumatiquement peut être employé pour étudier la mécanobiologie dans les cultures hydrogel 3D des chondrocytes de plaque de croissance. Le dispositif microfluidique est rentable et rentable dans le temps car il peut simultanément générer plusieurs magnitudes d’une compression sur de petits volumes d’échantillons, et diverses images microscopiques peuvent être appliquées avec l’appareil. Notre méthode peut également être appliquée à l’étude de la mécanobiologie d’autres types de cellules.
Pour configurer la couche de microcanal, mélangez d’abord PDMS avec un rapport de poids de 10 prépolymères à un agent de séchage pendant cinq minutes. Ensuite, placez le moule sur un tampon de mousse et versez le mélange dans le moule principal. Dégazer le PDMS dans une chambre à vide pendant 30 minutes et sandwich le PDMS dégazé avec un morceau de film de transparence.
Serrez l’assemblage en sandwich avec la plaque de verre, les coussinets en mousse et les plaques de plexiglas. Guérir le PDMS à 80 degrés Celsius pendant six heures et isoler la couche PDMS et le film de transparence de la structure en sandwich. Activez les surfaces du PDMS et une plaque de verre propre avec le nettoyeur plasma pendant une minute avant de lier le PDMS sur la plaque de verre dans le four à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Retirez ensuite le film de transparence. Pour la préparation de la fine membrane PDMS, faites tourner le PDMS non durci sur un film transparent à 1000 rotations par minute pendant une minute pour obtenir une couche PDMS de 60 micromètres d’épaisseur. Guérir partiellement le PDMS enduit de vrille à 80 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes avant d’utiliser le nettoyant plasmatique pour activer la couche PDMS microcanal sur la plaque de verre et la mince couche PDMS pendant une minute.
Ensuite, lier la fine couche de membrane PDMS sur la couche pdms microcanal et placer les couches dans le four de 80 degrés Celsius pendant la nuit. Pour la préparation du bloc de tubes, placer les tubes métalliques verticalement sur une boîte de Pétri et verser délicatement le PDMS non durci dans le plat jusqu’à ce qu’environ 3/4 des tubes soient submergés. Après avoir dégazé le PDMS dans une chambre à vide pendant 30 minutes, guérir le PDMS dans le four à 60 degrés Celsius pendant plus de six heures.
À la fin du processus de séchage, couper un morceau de bloc PDMS contenant un tube et percer un trou dans la fine couche PDMS pour l’entrée. Activez le bloc PDMS et la fine couche PDMS avec le nettoyeur plasma. Après une minute, fixez le bloc PDMS au trou d’entrée de la fine couche PDMS et placez toute l’unité d’actionnement dans le four à 80 degrés Celsius pendant la nuit.
Pour la préparation de moisissure de gel d’agarose, mélanger 5% d’agarose et 200 millimolar chlorure de calcium dans l’eau déionisée et chauffer la solution de gel agarose jusqu’à ébullition. Verser la solution de gel d’agarose bouillie dans un moule en aluminium et sandwich le moule avec la plaque de verre. Après cinq minutes, retirer le gel d’agarose solidifié du moule en aluminium.
Plaque 150 microlitres de solution alginate-chondrocyte sur la plaque de verre aminosilanized et couvrir la solution avec le moule de gel d’agarose pendant trois minutes. À la fin de l’incubation, utilisez une lame de rasoir pour enlever la solution excessive de gel d’alginate et retirer le moule de gel agarose de la plaque. Ensuite, placez les constructions alginate-chondrocyte en solution de liaison croisée contenant du chlorure de calcium de 50 millimlaires et du chlorure de sodium de 140 millimlaires dans de l’eau déionisée pendant une minute.
Pour assembler l’appareil, placez quatre espaceurs PDMS d’un millimètre d’épaisseur aux quatre coins de la mince couche PDMS de l’unité d’actionnement. Couvrir les chambres à air de la mince couche PDMS de 700 microlitres de milieu de culture des chondrocytes. À l’aide d’une microsope stéréo, placez la construction alginate-chondrocyte sur la mince couche PDMS, en prenant soin d’aligner les constructions avec les chambres à air, et pincez l’appareil avec des pinces imprimées en 3D.
Pour l’actionnement de l’appareil, utilisez un morceau de tube de silicium pour connecter la sortie d’une pompe à air avec l’entrée d’une valve solénoïde. Utilisez un tube supplémentaire pour connecter la sortie de la valve solénoïde avec l’entrée de l’appareil assemblé. Connectez la valve solénoïde avec un générateur de fonction et utilisez une onde carrée hertz produite par le générateur de fonction pour manipuler la valve solénoïde.
Ensuite, allumez la pompe à air pour actionner l’appareil pneumatiquement. Le dispositif de compression des chondrocytes microfluidiques contient cinq par cinq tableaux de constructions cylindriques d’alginate-chondrocyte et ces constructions peuvent être compressées avec cinq magnitudes différentes de compression. Dans cet exemple, la colonne de gel a été compressée de 33,8% de hauteur par le plus grand ballon PDMS et la souche compressive qui en résulte des constructions de gel a augmenté d’environ 5% par incrément de 0,2 millimètre et le diamètre du ballon PDMS.
La déformation compressive des chondrocytes a été déterminée en imagerie des cellules dans un 613 par 613 par 40 à 55 micromètres de volume près du centre de construction de gel. Ici, une image d’un chondrocyte qui a été comprimé de 16% par le plus grand ballon PDMS est montré. Dans ce graphique, la distribution des valeurs mesurées de la souche de compression cellulaire peut être observée.
Dans cette analyse, les cellules ont été compressées plus globalement par de plus grands ballons PDMS. Pris ensemble, ces données suggèrent que les quantités de gel alginate et de compression des chondrocytes sont contrôlées par le diamètre des ballons PDMS sous une pression constante de 14 kilopascals. Pour assurer la répétabilité des performances de l’appareil, la création d’une fine membrane PDMS avec une épaisseur et une élasticité constantes est cruciale.
À la suite de cette procédure, divers essais biologiques, tels que l’immunofluorescence et l’hybridation in situ peuvent être effectués. En utilisant cette technique, de nombreuses questions sur la mécanotransduction dans la plaque de croissance ou les chondrocytes articulaires peuvent être répondues.
