Este dispositivo de compressão microfluida ativado pneumaticamente pode ser usado para estudar a mecanobiologia em culturas de hidrogel 3D de condrócitos de placas de crescimento. O dispositivo microfluido é econômico e demorado porque pode simultaneamente gerar múltiplas magnitudes de uma compressão em pequenos volumes de amostras, e várias imagens microscópicas podem ser aplicadas com o dispositivo. Nosso método também pode ser aplicado ao estudo da mecanobiologia de outros tipos de células.
Para configurar a camada microcanal, misture primeiro o PDMS com uma razão de peso de 10 prepolímeros para um agente de cura por cinco minutos. Em seguida, coloque o molde em uma almofada de espuma e despeje a mistura no molde mestre. Degas o PDMS em uma câmara de vácuo por 30 minutos e sanduíche o PDMS desgaseado com um pedaço de filme de transparência.
Aperte o conjunto sanduíche com a placa de vidro, almofadas de espuma e placas de plexiglass. Cure o PDMS a 80 graus Celsius por seis horas e isole a camada PDMS e o filme de transparência da estrutura sanduíche. Ative as superfícies do PDMS e uma placa de vidro limpa com o limpador de plasma por um minuto antes de ligar o PDMS à placa de vidro no forno Celsius de 80 graus por 30 minutos.
Em seguida, remova o filme de transparência. Para a preparação da fina membrana PDMS, gire o PDMS sem correção em uma película de transparência a 1.000 rotações por minuto durante um minuto para obter uma camada PDMS de 60 micrômetros de espessura. Cure parcialmente o PDMS revestido de spin a 80 graus Celsius por 20 a 30 minutos antes de usar o limpador de plasma para ativar a camada PDMS microcanal na placa de vidro e na fina camada PDMS por um minuto.
Em seguida, conecte a fina camada de membrana PDMS à camada PDMS microcanal e coloque as camadas no forno Celsius de 80 graus durante a noite. Para a preparação do bloco de tubulação, coloque os tubos metálicos verticalmente em uma placa de petri e despeje suavemente PDMS nãocurados na placa até que cerca de 3/4 dos tubos estejam submersos. Depois de desgasear o PDMS em uma câmara de vácuo por 30 minutos, cure o PDMS no forno a 60 graus Celsius por mais de seis horas.
No final do processo de cura, corte um pedaço de bloco PDMS contendo um tubo e faça um furo na fina camada PDMS para a entrada. Ative o bloco PDMS e a fina camada PDMS com o limpador de plasma. Após um minuto, conecte o bloco PDMS ao orifício de entrada da fina camada PDMS e coloque toda a unidade de atuação no forno a 80 graus Celsius durante a noite.
Para a preparação do molde de gel de agarose, misture 5% de agarose e 200 cloreto de cálcio mililitro em água deionizada e aqueça a solução de gel de agarose até ferver. Despeje a solução de gel de agarose cozida em um molde de alumínio e sanduiche o molde com a placa de vidro. Após cinco minutos, remova o gel de agarose solidificado do molde de alumínio.
Placa 150 microliters de solução de alginato-condrocyte na placa de vidro aminosilanizada e cubra a solução com molde de gel agarose por três minutos. No final da incubação, use uma lâmina de barbear para remover a solução excessiva de gel alginato e remover o molde de gel de agarose da placa. Em seguida, coloque as construções de alginato-condrocito em solução transversal contendo 50 mililitros de cálcio e 140 milimilas de cloreto de sódio em água desionizada por um minuto.
Para montar o dispositivo, localize quatro espaçadores PDMS de um milímetro de espessura nos quatro cantos da fina camada PDMS da unidade de atuação. Cubra as câmaras de ar da fina camada PDMS com 700 microliters de meio de cultura condrócito. Utilizando um microsope estéreo, coloque o construto alginato-condrocito sobre a fina camada PDMS, tomando o cuidado de alinhar os construtos com as câmaras de ar e fixar o dispositivo com grampos impressos em 3D.
Para atuação do dispositivo, use um pedaço de tubo de silício para conectar a saída de uma bomba de ar com a entrada de uma válvula solenoide. Use um pedaço adicional de tubulação para conectar a saída da válvula solenoide com a entrada do dispositivo montado. Conecte a válvula solenoide com um gerador de função e use uma onda quadrada de hertz gerada pelo gerador de função para manipular a válvula solenoide.
Em seguida, ligue a bomba de ar para acionar o dispositivo pneumaticamente. O dispositivo de compressão de condrocitos microfluidos contém cinco por cinco matrizes de construtos cilíndricos alginato-condrócito e esses construtos podem ser comprimidos com cinco magnitudes diferentes de compressão. Neste exemplo, a coluna de gel foi comprimida por 33,8% de altura pelo maior balão PDMS e a cepa compressiva resultante dos construtos de gel aumentou aproximadamente 5% por incremento de 0,2 milímetros e o diâmetro do balão PDMS.
A deformação compressiva dos condrócitos foi determinada por imagem das células em um volume de 613 por 613 por 40 a 55 micrômetros perto do centro de construção de gel. Aqui é mostrada uma imagem de um condrócito que foi comprimido por 16% pelo maior balão PDMS. Neste gráfico, pode-se observar a distribuição dos valores da cepa de compressão celular medida.
Nesta análise, as células foram compactadas mais globalmente por balões PDMS maiores. Juntos, esses dados sugerem que as quantidades de gel alginato e compressão de condrocitos são controladas pelo diâmetro dos balões PDMS sob uma pressão constante de 14 quilopascals. Para garantir a repetibilidade do desempenho do dispositivo, é crucial criar uma membrana PDMS fina com espessura e elasticidade constantes.
Após esse procedimento, podem ser realizados diversos ensaios biológicos, como a imunofluorescência e a hibridização in situ. Utilizando essa técnica, muitas perguntas sobre mecanotransdução em placa de crescimento ou condrócitos articular podem ser respondidas.
