Bu protokol, tam böbrekte üç boyutlu yapıların görselleştirilmesine izin verir, bu da makroskopik bir bakış açısı sağlayarak böbrek araştırmalarında yenilikçi keşiflere yol açabilir. Tüm organ boyama işlemi, antikor penetrasyonundaki zorluk nedeniyle zordur. Bu protokol, böbreklerin antikorlar tarafından yüksek kaliteli, tam montajlı boyanmasını göstermiştir.
Başlamak için, perfüzyon fiksasyonu ve böbrek örneklemesinden hemen sonra, böbreği 16 saat boyunca dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit içine batırarak daldırma fiksasyonunu gerçekleştirin. PBS kullanarak her biri iki saat boyunca üç yıkama yapın. Sabit böbreği, oda sıcaklığında hafifçe sallanarak, 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe yedi milimetre% 50 CUBIC-L'ye batırarak renk giderme ve delipidasyon işlemini gerçekleştirin.
Altı saat sonra, böbreği 14 milimetrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe yedi mililitre CUBIC-L'ye batırın ve beş gün boyunca 37 santigrat derecede hafifçe sallayın. CUBIC-L'yi her gün yenileyin. Renk giderme ve delipidasyon tamamlandıktan sonra, numune işleme için bir dağıtım kaşığı kullanın ve böbreği iki saat boyunca oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın.
Boyama tampon çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorlarda delipide olmuş böbreği immünoboyar, yedi gün boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatör çalkalayıcısında hafifçe sallanır. Daha sonra, böbreği% 0.5Triton X-100 ile PBS'de, PBST olarak da bilinir, bir gün boyunca oda sıcaklığında yıkayın. İkincil antikorların boyanması için, böbreği boyama tamponunda, karanlıkta, yedi gün boyunca 37 santigrat derecede hafifçe sallayarak ikincil antikorlarla tedavi edin.
Lekelenmeyi bir gün boyunca oda sıcaklığında PBST yıkama ile sabitleyin. Fiksasyon sonrası, böbreği üç saat boyunca PB'de% 1 formaldehit içine batırın ve altı saat boyunca oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. Böbreği% 50 CUBIC-R + 'nın yedi mililitrelik bir yuvarlak alt tüpüne bir gün boyunca sallayarak batırarak kırılma indisi eşleşmesini gerçekleştirin, ardından iki gün boyunca oda sıcaklığında sallanarak yedi mililitre CUBIC-R + ile tedavi edin.
İmmün boyama yöntemi yardımıyla bütün böbrekteki sempatik sinirler ve arterler 3D böbrek görüntülemede görselleştirildi. Ayrıca iskemi-reperfüzyon hasarı sonrası anormal renal sempatik sinirler görüntülendi. Bu protokol aynı zamanda tüm dalaktaki sempatik sinirlerin görselleştirilmesini kolaylaştırdı.
Üç boyutlu immünofloresan boyama için veri niceleme işlemi burada gösterilmektedir. Ek olarak, toplama kanalları, proksimal tübüllerin S1 segmenti ve glomerüller bütün bir böbrekte başarıyla görselleştirildi. Diyabetik böbrek hastalığının erken evrelerinde ilaç uygulamasından kaynaklanan baskılanmış glomerülomegali, 3D görüntülemede de görselleştirildi.
Bu protokol, tüm böbrek içindeki spesifik molekülü etiketleyebilir. Böylece, araştırmacılar vaskülatüründeki yapı değişikliğini analiz edebilir veya böbrek dokularında nadir olaylar bulabilirler.
