Dieses Protokoll stellt das erste Forschungsmodell vor, das eine organotypische langfristige Kultivierung von hornförmigen Endothelzellen ermöglicht, die mit der Herstellung von gespaltenen Hornhautknöpfen erreicht werden. Durch teilweises Entfernen der äußeren Hornhautschichten wird der Verlust der Endothelzellverlorenen signifikant reduziert, so dass horneale Endothelzellen für mindestens 15 Tage kultiviert werden können. Daher ist dieses Modell wertvoll für die Untersuchung der Auswirkungen bestimmter Substanzen oder Techniken von Interesse wie Bewässerungslösungen oder ophthalmologische viskoelastische Geräte auf das Hornhautendothel.
Nach Erhalt von Schweineaugen, die kurz nach dem Tod entfernt wurden, verwenden Sie Augenschere und Colibri Zangen, um alle Orbitaladnexe zu entfernen. Legen Sie fünf bis sechs Augen in fünf Prozent Jod-PBS-Lösung für insgesamt fünf Minuten, um die Augenoberflächen richtig zu desinfizieren, mit sorgfältigem Rühren einmal pro Minute, um sicherzustellen, dass die Oberflächen vollständig untergetaucht sind, um eine vollständige Desinfektion zu erreichen. Nach fünf Minuten die desinfizierten Augen auf eine Tasse reines PBS übertragen und vorsichtig rühren, um die Jod-PBS-Lösung gründlich von den Augenoberflächen zu waschen.
Bevor Sie mit der Zerlegung beginnen, füllen Sie mit einem stumpfen Katheter eine Fünf-Milliliter-Spritze mit zwei Millilitern frisch aufgetautem fetalem Kalbsserum und sanzen Sie das Serum durch einen 0,22-Mikrometer-Filter in 80 Milliliter dextranfreies Kulturmedium. Rühren Sie die Mischung sanft, um eine homogene Verteilung des Serums zu erreichen, und fügen Sie drei Milliliter des Mediums zu jedem Brunnen einer 12-Well-Zellkulturplatte hinzu. Wenn die Platte fertig ist, übertragen Sie eine Glühbirne in einen Augenzwiebelhalter unter einem ophthalmologischen chirurgischen Mikroskop mit der Hornhaut nach oben, und verwenden Sie eine Spritze gefüllt mit 0,9% Natriumchlorid, um das Auge über den Augenlampenhalter leicht zu saugen, um das Auge an Ort und Stelle zu fixieren.
Verwenden Sie ein Trephin mit einer standardisierten Inlay, um oberflächlich in die zentrale Hornhaut zu schneiden, nicht tiefer als 300 Mikrometer, und verwenden Sie Colibri Zangen und ein Einweg-Skalpell mit einer dreieckigen Klinge, um das teilweise trephinierte Fragment der Hornhaut horizontal durch die Stroma zu schneiden und zu entfernen. Oberflächlich eine 10-0-Naht in die Stroma legen, um eine Differenzierung des Endothels von der stromalen Seite während der Experimente zu ermöglichen, ohne das Hornhautendothel zu durchdringen, und verwenden Sie ein Trephin ohne Inlay, um den Trephinschnitt bis zur vollen Tiefe zu erreichen, bis die vordere Augenkammer erreicht ist. Ein deutlicher Rückgang des Widerstands und flüssigkeitsaustritt aus der vorderen Augenkammer kann nach vollständiger Penetration der Hornhaut wahrgenommen werden.
Legen Sie den erhaltenen gespaltenen Hornhautknopf mit einem Teil des Stromas, der Descemet-Membran und des Hornhautendothels in einen Brunnen der 12-Well-Platte mit der getaggten Seite nach unten. Dann beschriften Sie jeden Brunnen auf der Kulturplatte mit einer individuellen Nummer für jeden geteilten Hornhautknopf zur Identifikation während der Nachuntersuchungen. Wenn alle Hornhautknöpfe gesammelt wurden, legen Sie die 12-Well-Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit und ersetzen Sie den Überstand am achten Tag, wenn eine siebentägige Inkubationszeit überschritten wird.
Um eine unbefleckte Untersuchung durchzuführen, fügen Sie drei Milliliter hypotonisch ausgewogene Salzlösung zu jedem Brunnen einer 12-Well-Platte hinzu, und legen Sie sorgfältig einen einzigen gespaltenen Hornhautknopf in jeden Brunnen, um Schwellungen der hornförmigen Endothelzellen zu induzieren und die Sichtbarkeit der Zellen zum Zählen zu verbessern. Nach ein bis zwei Minuten können Sie mit einer Mikroskopkamera mindestens drei Bilder von drei verschiedenen Bereichen des Endothels erfassen, um einen repräsentativen Eindruck vom tatsächlichen Zustand des Hornhautendothel zu erhalten, und fügen Sie für eine spätere Analyse einen Maßstabsbalken mit der maßstabsgetreuen Länge von 100 Mikrometern hinzu. Um osmotische Schäden zu vermeiden, übertragen Sie den gespaltenen Hornhautknopf nach maximal fünf Minuten zurück in das Kulturmedium.
Um eine gefärbte Untersuchung durchzuführen, legen Sie die gespaltenen Hornhautknöpfe in einzelne Petrischalen, endotheliale Seite nach oben, und verwenden Sie eine Pipette, um langsam 0,25%Trypam blaue Lösung auf jedes Hornhautendothel für 90 Sekunden pro Probe fallen. Als nächstes spülen Sie die Knöpfe dreimal in 0,9% Natriumchlorid in einem kleinen Glasbecher, bevor Sie eine Pipette verwenden, um langsam 0,2% Alizarin Red S Lösung auf die Endothelie für 90 Sekunden fallen. Dann stellen Sie die Proben, wie gerade gezeigt.
Um die Bilder für die Bewertung der Zelldichte und Morphologie vorzubereiten, öffnen Sie die Bilder in einem geeigneten Grafikbearbeitungssoftwareprogramm und projizieren Sie ein Quadrat mit einer maßstabsgetreuen Seitenlänge von 100 Mikrometern auf das Bild. Um die Maßstabsleiste zuzuschneiden, verwenden Sie das rechteckige Festzeltwerkzeug, um die Maßstabsleiste einzugrenzen, und wählen Sie Bearbeiten und Zuschneiden aus. Klicken Sie auf Datei und Neu, und wählen Sie zwischendiebe aus.
Notieren Sie sich die entsprechenden Pixel für die anderen Bilder, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie erneut auf Datei und Neu, und fügen Sie die Breite und Länge des Zählquadrats in Pixel in Pixel nderpixeln entsprechend der Länge der Maßstabsleiste ein. Wählen Sie Weiß als Hintergrundfarbe aus, und klicken Sie auf OK, um alle auszuwählen, und kopieren Sie das ausgewählte Bild. Wählen Sie das Bild des Hornhautendotheles und fügen Sie das Quadrat auf das Hornhautendothel ein.
Wählen Sie die quadratische Ebene aus, und legen Sie die Deckkraft auf 30% fest, dann klicken Sie auf OK und speichern Sie das Bild mit dem projizierten Quadrat mit der maßstabsgetreuen Folienlänge von 100 Mikrometern. Um die Endothelzelldichte zu bewerten, öffnen Sie die Bilder mit den projizierten Quadraten in ImageJ, und öffnen Sie das Zellenzähler-Plugin. Um die Zellen innerhalb des Quadrats zu zählen, klicken Sie auf Initialisieren, um die Endothelzellen auf zwei Seiten des Quadrats zu zählen, und zeichnen Sie das Ergebnis auf.
Um die morphologischen Parameter zu bewerten, zählen Sie das gemeinsame Treffen von mindestens vier Zellen pro Zellrand, das charakteristische Rosette-förmige Aussehen und die Alizarin-Rot-Bereiche innerhalb der projizierten Quadrate. Über einen Zeitraum von 15 Tagen zeigen gespaltene Hornhautknöpfe einen stetigen Rückgang der Endothelzelldichte, wobei ein durchschnittlicher wöchentlicher prozentualer prozentualer Endothelzellverlust von 4,90%die Färbung der Endothelzellschicht am 15. Tag eine morphologische Analyse der Hornhautzellen ermöglicht, wobei die Reformationszahlen etwa sieben Prozent der verschmelzenden Zellgrenzen ausmachen, ein Median von etwa einer Rosettebildung pro Millimeter quadratisch pro Millimeter und etwa 13 punktuelle Zellverluste pro Millimeter im Quadrat. Hierkönnen können repräsentative Bilder des Hornhautendotheles bei der mikroskopischen Auswertung in hypotonischer ausgewogener Salzlösung und nach der Färbung mit Trypan blue und Alizarin Red S beobachtet werden.
Wenn die gespaltenen Hornhautknöpfe mit der endotheliale Seite nach unten kultiviert werden, ist mit umfangreichen Endothelzellschäden zu rechnen. Nicht gespaltene Hornhautknöpfe erleiden einen signifikant erhöhten Endothelzellverlust aufgrund von stromaler Schwellung, wodurch Sichcemets Membran über 15 Tage der Kultivierung faltet, während gespaltene Hornhautknöpfe nach 15 Tagen Kultivierung ein weitgehend erhaltenes Hornhautendothel aufweisen, wie die verstreuten punktuellen Alizarin-Rotfärbungsgebiete belegen, die auf einzelne zerstörte Zellen hinweisen. Um den Zellverlust zu minimieren, sollte darauf geachtet werden, das Hornhautendothel in allen Schritten dieses Protokolls nicht zu berühren.
