Ce protocole présente le premier modèle de recherche permettant la culture organotypique à long terme des cellules endothéliales cornéeles obtenues avec la préparation des boutons cornéens fendu. En enlevant partiellement les couches cornéennes externes, la perte de cellules endothéliales est considérablement réduite, permettant la culture de cellules endothéliales cornéeles pendant au moins 15 jours. Par conséquent, ce modèle est précieux pour étudier les effets de substances ou de techniques d’intérêt spécifiques telles que les solutions d’irrigation ou les dispositifs viscoélastiques ophtalmiques sur l’endothélium cornéen.
Après avoir reçu des yeux de porc qui ont été enlevés peu de temps après mortem, utilisez des ciseaux oculaires et des forceps Colibri pour enlever tous les adnexes orbitaux. Placez cinq à six yeux dans la solution PBS d’iode à cinq pour cent pendant un total de cinq minutes pour désinfecter correctement les surfaces oculaires, en remuant soigneusement une fois par minute pour s’assurer que les surfaces sont complètement submergées pour obtenir une désinfection complète. Après cinq minutes, transférer les yeux désinfectés dans une tasse de PBS pur, et remuer soigneusement pour bien laver la solution pbs iode des surfaces oculaires.
Avant de commencer la dissection, utilisez un cathéter contondant pour remplir une seringue de cinq millilitres avec deux millilitres de sérum de veau fœtal fraîchement décongelé, et filtrez le sérum à travers un filtre de 0,22 micromètre en 80 millilitres de milieu de culture sans dextran. Agiter doucement le mélange pour obtenir une distribution homogène du sérum, et ajouter trois millilitres du milieu à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits. Lorsque la plaque est prête, transférer une ampoule oculaire dans un support d’ampoule oculaire sous un microscope chirurgical ophtalmique avec la cornée face vers le haut, et utiliser une seringue remplie de chlorure de sodium de 0,9% pour appliquer une légère aspiration à l’œil sur le support de l’ampoule pour fixer l’œil en place.
Utilisez une tréphine contenant une incrustation normalisée pour couper superficiellement dans la cornée centrale, pas plus profond que 300 micromètres, et utilisez des forceps Colibri et un scalpel à usage unique avec une lame triangulaire pour couper et enlever le fragment partiellement trephined de la cornée horizontalement à travers le stroma. Placez superficiellement une suture 10-0 dans le stroma pour permettre la différenciation de l’endothélial du côté stromal pendant les expériences, sans pénétrer l’endothélium cornéen, et utilisez une tréphine sans incrustation pour avancer la coupe de tréphine à la pleine profondeur jusqu’à ce que la chambre antérieure d’oeil soit atteinte. Une baisse distincte de la résistance et du liquide qui fuit de la chambre antérieure de l’œil peut être perçue après une pénétration complète de la cornée.
Placez le bouton cornéen fendu obtenu contenant une partie du stroma, la membrane du Descemet et l’endothélium cornéen dans un puits de la plaque de 12 puits avec le côté marqué orienté vers le bas. Étiquetez ensuite chaque puits sur la plaque de culture avec un numéro individuel pour chaque bouton cornéen fendu pour identification pendant les suivis. Lorsque tous les boutons cornéens ont été recueillis, placez la plaque de 12 puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité, remplaçant le supernatant le huitième jour si une période d’incubation de sept jours est dépassée.
Pour effectuer un examen non taché, ajouter trois millilitres de solution de sel hypotonique équilibrée à chaque puits d’une plaque de 12 puits, et placer soigneusement un seul bouton cornéen fendu dans chaque puits pour induire un gonflement des cellules endothéliales cornéeles, et pour améliorer la visibilité des cellules pour le comptage. Après une à deux minutes, utilisez une caméra microscope pour acquérir au moins trois images de trois zones différentes de l’endothélium afin d’obtenir une impression représentative de l’état réel de l’endothélium cornéen, et ajoutez une barre d’échelle d’une longueur réelle de 100 micromètres pour une analyse ultérieure. Pour éviter les dommages osmotiques, transférez le bouton cornéen fendu de la solution après un maximum de cinq minutes dans le milieu de culture.
Pour effectuer un examen taché, placez les boutons cornéens fendu dans des boîtes de Pétri individuelles, côté endothélial vers le haut, et utilisez une pipette pour laisser tomber lentement 0.25%Trypam solution bleue sur chaque endothélium cornéen pendant 90 secondes par spécimen. Ensuite, rincez soigneusement les boutons trois fois dans du chlorure de sodium à 0,9 % dans un petit bécher en verre avant d’utiliser une pipette pour laisser tomber lentement la solution Alizarin Red S sur l’endothélie pendant 90 secondes. Puis l’image des échantillons comme vient de le démontrer.
Pour préparer les images à l’évaluation de la densité cellulaire et de la morphologie, ouvrez les images dans un logiciel d’édition graphique approprié et projetez un carré d’une longueur latérale fidèle à l’échelle de 100 micromètres sur l’image. Pour recadrer la barre d’échelle, utilisez l’outil rectangulaire de chapiteau pour border la barre d’échelle et sélectionner modifier et recadrer. Cliquez sur fichier et nouveau, et sélectionnez presse-papiers.
Notez les pixels correspondants pour les autres photos et cliquez sur OK. Cliquez à nouveau sur fichier et nouveau, et insérez la largeur et la longueur du carré de comptage en pixels dans la fenêtre contexturée en fonction de la longueur de la barre d’échelle. Sélectionnez blanc comme couleur de fond, et cliquez sur OK pour sélectionner tous, et copier l’image sélectionnée. Sélectionnez l’image de l’endothélium cornéen et coller le carré sur l’endothélium cornéen.
Sélectionnez la couche carrée et réglez l’opacité à 30%, puis cliquez sur OK et enregistrer l’image avec le carré projeté avec la longueur de diapositives fidèle à l’échelle de 100 micromètres. Pour évaluer la densité des cellules endothéliales, ouvrez les images avec les carrés projetés dans ImageJ et ouvrez le plugin du compteur cellulaire. Pour compter les cellules à l’intérieur du carré, cliquez sur initialiser pour compter les cellules endothéliales sur les deux côtés du carré, et enregistrer le résultat.
Pour évaluer les paramètres morphologiques, comptez la réunion conjointe d’au moins quatre cellules par bordure cellulaire, l’apparence caractéristique en forme de rosette et les zones rouges d’Alizarin dans les carrés projetés. Sur une période de 15 jours, les boutons cornéens fractionnés démontrent une diminution constante de la densité des cellules endothéliales, avec un pourcentage hebdomadaire moyen de perte de cellules endothéliales de 4,90 %, la coloration de la couche cellulaire endothéliale le jour 15 permet une analyse morphologique des cellules cornéennes, les chiffres de réforme mentant environ sept pour cent des bordures cellulaires fusionnelles, médiane d’environ une formation de rosette par millimètre carré par échantillon. , et environ 13 pertes ponctuelles de cellules par millimètre au carré. Ici, des images représentatives de l’endothélium cornéen pendant l’évaluation microscopique dans la solution équilibrée hypotonique de sel, et après coloration avec le bleu de Trypan et le S rouge d’Alizarin, peuvent être observées.
Si les boutons cornéens fendu sont cultivés avec le côté endothélial face vers le bas, des dommages importants de cellules endothéliales sont à prévoir. Les boutons cornéens non fendu souffrent d’une perte de cellules endothéliales significativement accrue due à un gonflement stromal, causant le pliage de la membrane de Descemet pendant 15 jours de culture, tandis que les boutons cornéens fendus présentent un endothélium cornéen largement préservé après 15 jours de culture, comme en témoignent les zones ponctuelles dispersées d’Alizarin teintées de rouge, indicatifs de cellules détruites simples. Pour minimiser la perte de cellules, il faut prendre soin de ne pas toucher l’endothélium cornéen à toutes les étapes de ce protocole.
