يقدم هذا البروتوكول النموذج البحثي الأول الذي يسمح بزراعة الخلايا البطانية القرنية على المدى الطويل من الخلايا القرنية التي تحققت مع إعداد أزرار القرنية المنقسمة. عن طريق إزالة جزئيا طبقات القرنية الخارجية، يتم تقليل فقدان الخلايا البطانية بشكل كبير، مما يسمح بزراعة الخلايا البطانية القرنية لمدة 15 يوما على الأقل. ولذلك، فإن هذا النموذج قيمة للتحقيق في آثار مواد محددة أو تقنيات ذات فائدة مثل حلول الري أو الأجهزة الفيسكويلاستيكية العينية على endothelium القرنية.
بعد تلقي عيون الخنازير التي أزيلت بعد الوفاة بعد فترة وجيزة، واستخدام مقص العين والملقط القولونية لإزالة كل من adnexes المدارية. ضع خمسة إلى ستة عيون في محلول PBS اليود في خمسة في المئة لمدة خمس دقائق لتطهير أسطح العين بشكل صحيح ، مع التحريك الدقيق مرة واحدة في الدقيقة لضمان غمر الأسطح بالكامل لتحقيق تطهير كامل. بعد خمس دقائق، نقل العينين المطهرتين إلى كوب من برنامج تلفزيوني نقي، وتحريك بعناية لغسل دقيق محلول برنامج تلفزيوني اليود من أسطح العين.
قبل البدء في تشريح, استخدام قسطرة حادة لملء حقنة خمسة ملليلتر مع مليلتر اثنين من مصل عجل الجنين ذاب حديثا, وسلالة المصل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر في 80 ملليلتر من الدكستران خالية من الثقافة المتوسطة. يهيج بلطف الخليط لتحقيق توزيع متجانس للمصل، وإضافة ثلاثة ملليلترات من المتوسطة إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلايا 12-جيدا. عندما تكون اللوحة جاهزة، قم بنقل لمبة عين إلى حامل لمبة العين تحت مجهر جراحي للعيون مع القرنية التي تواجهها، واستخدم حقنة مملوءة بكلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪لتطبيق شفط طفيف على العين على حامل لمبة العين لإصلاح العين في مكانها.
استخدام التريبين التي تحتوي على تطعيم موحدة لقطع سطحيا في القرنية المركزية، لا أعمق من 300 ميكرومتر، واستخدام ملقط كوليبري ومشرط واحد الاستخدام مع شفرة مثلثة لقطع وإزالة جزء من القرنية جزئيا من خلال ستروما. وضع سطحيا خياطة 10-0 في ستروما للسماح التمايز من endothelial من الجانب stromal خلال التجارب، دون اختراق endothelium القرنية، واستخدام trephine دون تطعيم للتقدم قطع trephine إلى العمق الكامل حتى يتم التوصل إلى غرفة العين الأمامية. ويمكن أن ينظر إلى انخفاض واضح في المقاومة والسوائل تسرب من غرفة العين الأمامية بعد اختراق كامل للقرنية.
ضع زر القرنية المنقسم الذي تم الحصول عليه الذي يحتوي على جزء من الستروما، وغشاء Descemet، وشقة القرنية في بئر واحد من لوحة 12-well مع الجانب الموسومة التي تواجه لأسفل. ثم تسمية كل بئر على لوحة الثقافة مع عدد فردي لكل زر قرنية تقسيم لتحديد أثناء عمليات المتابعة. عندما تم جمع جميع أزرار القرنية ، ضع لوحة 12 بئرًا في حاضنة ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، وخمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون ، والرطوبة بنسبة 95 ٪ ، لتحل محل السوبر في اليوم الثامن إذا تم تجاوز فترة حضانة لمدة سبعة أيام.
لإجراء فحص غير مطعّم، أضف ثلاثة ملليلترات من محلول الملح المتوازن الهابطي إلى كل بئر من ألواح 12 بئرًا، واتّسم بعناية زر قرنية منقسم في كل بئر للحث على تورم الخلايا البطانية القرنية، وتحسين رؤية الخلايا للعد. بعد دقيقة إلى دقيقتين، استخدم كاميرا المجهر للحصول على ما لا يقل عن ثلاث صور لثلاث مناطق مختلفة من بطانة الغدد العضلية للحصول على انطباع تمثيلي للحالة الفعلية للاندورفين القرنية، وإضافة شريط مقياس بطول صحيح إلى مقياس 100 ميكرومتر للتحليل لاحقًا. لمنع تلف التناضح، قم بنقل زر القرنية المنقسم من الحل بعد خمس دقائق كحد أقصى إلى الوسط الثقافي.
لإجراء فحص ملون، ضع أزرار القرنية المنقسمة في أطباق بيتري الفردية، والجانب البطاني للأعلى، واستخدم ماصة لإسقاط 0.25٪ Trypam حل أزرق على كل endothelium القرنية لمدة 90 ثانية لكل عينة. المقبل، بعناية شطف الأزرار ثلاث مرات في كلوريد الصوديوم 0.9٪في كوب زجاجي صغير قبل استخدام ماصة لإسقاط ببطء 0.2٪ Alizarin الأحمر S الحل على endothelia لمدة 90 ثانية. ثم صورة العينات كما أظهرت للتو.
لإعداد الصور لتقييم كثافة الخلايا ومورفولوجيا، افتح الصور في برنامج تحرير الرسومات المناسب ومشروع مربع مع طول الجانب الحقيقي إلى مقياس من 100 ميكرومتر على الصورة. لاقص شريط المقياس، استخدم أداة التحديد المستطيلة لتحديد شريط المقياس وتحديد التحرير والمحاصيل. انقر فوق ملف وجديد، وحدد الحافظة.
لاحظ وحدات البكسل المقابلة للصور الأخرى وانقر فوق موافق. انقر فوق ملف وجديد مرة أخرى، ثم قم بإدراج عرض وطول مربع العد بالبكسل في الإطار المنبثق وفقاً لطول شريط المقياس. حدد الأبيض كـ لون خلفية، ثم انقر فوق موافق لتحديد الكل، ثم نسخ الصورة المحددة. حدد صورة endothelium القرنية ولصق مربع على endothelium القرنية.
حدد الطبقة المربعة وقم بتعيين التعتيم إلى 30٪ ثم انقر فوق موافق ثم احفظ الصورة مع المربع المسقط بطول الشريحة الحقيقية إلى الحجم 100 ميكرومتر. لتقييم كثافة الخلايا البطانية، افتح الصور مع المربعات المتوقعة في ImageJ، وافتح المكوّن الإضافي لعارض الخلية. لحساب الخلايا داخل المربع، انقر فوق تهيئة لحساب الخلايا البطانية على جانبي المربع، ثم قم بتسجيل النتيجة.
لتقييم المعلمات المورفولوجية، عد الاجتماع المشترك لا يقل عن أربع خلايا لكل حد خلية، والمظهر المميز على شكل وردة، ومناطق أليسارين الأحمر داخل المربعات المتوقعة. على مدى فترة 15 يوما، أزرار القرنية الانقسام تظهر انخفاضا مطردا في كثافة الخلايا البطانية، مع متوسط نسبة أسبوعية فقدان الخلايا البطانية من 4.90٪ تلطيخ طبقة الخلية البطانية في اليوم 15 يسمح التحليل المورفولوجي للخلايا القرنية، مع أرقام الإصلاح تشكل ما يقرب من سبعة في المئة من حدود الخلية دمج، وهو متوسط لتشكيل وردة واحدة تقريبا لكل عينة ملليمتر مربع ، وحوالي 13 فقدان الخلايا في الوقت المحدد لكل ملليمتر مربع. هنا، يمكن ملاحظة صور تمثيلية للبصال القرنية خلال التقييم المجهري في محلول الملح المتوازن الهاونتوني، وبعد التلطيخ باللون الأزرق Trypan وAlzarin Red S.
إذا كانت تزرع أزرار القرنية الانقسام مع الجانب البطانية التي تواجه أسفل، من المتوقع الأضرار واسعة الخلايا البطانية. أزرار القرنية غير المنقسمة تعاني من زيادة كبيرة في فقدان الخلايا البطانية بسبب تورم السترومال ، مما تسبب في طي غشاء Descemet على مدى 15 يومًا من الزراعة ، في حين أن أزرار القرنية المنقسمة تظهر بطانة قرنية محفوظة إلى حد كبير بعد 15 يومًا من الزراعة ، كما يتضح من المناطق المتناثرة الملطخة بالمواعيد Alizarin Red الملطخة ، مما يدل على وجود خلايا واحدة مدمرة. لتقليل فقدان الخلايا، يجب الحرص على عدم لمس بطانة القرنية في جميع مراحل هذا البروتوكول.
