このプロトコルは、分割角膜ボタンの調製により達成された角膜内皮細胞の有機的な長期培養を可能にする最初の研究モデルを提示する。外側角膜層を部分的に除去することにより、内皮細胞損失が著しく減少し、角膜内皮細胞の培養を少なくとも15日間可能にする。したがって、このモデルは、特定の物質や、角膜内皮に対する灌漑溶液や眼用粘弾性デバイスなどの目的の技術の影響を調査するのに有用です。
死後まもなく取り除かれた豚の目を受け取った後、眼はさみと大腸菌の鉗子を使用して、すべての軌道アドネックスを取り除きます。5~6個のアイオウ素PBS溶液に5~6個の目を5分入れ、眼表面を適切に消毒し、1分間に1回慎重に攪拌して表面が完全に水没して完全に消毒を達成します。5分後、除菌した目を純粋なPBSのカップに移し、慎重に攪拌して眼表面からヨウ素PBS溶液を十分に洗浄します。
解剖を開始する前に、鈍いカテーテルを使用して、解凍したばかりの胎児の子牛血清の2ミリリットルで5ミリリットルの注射器を充填し、0.22マイクロメートルフィルターを通して80ミリリットルのデキストランフリー培地に血清をひずみます。混合物を穏やかに攪拌して血清の均質な分布を達成し、12ウェル細胞培養プレートの各ウェルに培地の3ミリリットルを加える。プレートの準備ができたら、角膜を上に向けた眼科手術顕微鏡の下で眼球ホルダーに眼球球を移し、0.9%塩化ナトリウムで満たされた注射器を使用して、目の角を目にわずかに吸引して目を固定します。
標準化されたインレーを含むトレフィンを使用して、300マイクロメートル以下の中央角膜に表面的に切断し、コリブリ鉗子と三角形の刃を持つ単一使用メスを使用して、角膜の部分的にトレフィンされた断片を水平に切断し、除去します。表面的には、角膜内皮を貫通することなく、実験中に間質側から内皮の分化を可能にするために間質に10-0の縫合糸を配置し、前眼室が到達するまでトレフィンカットを完全な深さまで進めるためにインレーなしでトレフィンを使用する。前眼房からの漏れ抵抗および液体の明確な低下は角膜の完全な浸透の後に知覚することができる。
得られた分割角膜ボタンに、ストロマの一部、デシェメットの膜、角膜内皮を、タグ付けされた側面を下に向けた12ウェルプレートの1ウェルに配置します。その後、フォローアップ中に識別するために、各分割角膜ボタンの個々の番号で培養プレート上の各ウェルにラベルを付けます。すべての角膜ボタンが採取されたら、12ウェルプレートを細胞培養インキュベーターに摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%に置き、7日間のインキュベーション期間を超えた場合は8日目に上清を置き換えます。
染色されていない検査を行うには、12ウェルプレートの各ウェルに低張性バランス塩溶液を3ミリリットル加え、各ウェルに1つの分割角膜ボタンを慎重に配置して角膜内皮細胞の腫脹を誘発し、カウントするための細胞の視認性を向上させます。1~2分後、顕微鏡カメラを使用して、3つの異なる領域の画像を取得し、角膜内皮の実際の状態の代表的な印象を得て、後で分析するために100マイクロメートルの実スケール長さのスケールバーを追加します。浸透性損傷を防ぐために、溶液から分割角膜ボタンを最大5分後に培地に戻します。
染色検査を行うには、分割角膜ボタンを個々のペトリ皿に置き、内皮側を上に置き、ピペットを使用して0.25%トリパムブルー溶液を各角膜内皮に1標本あたり90秒間ゆっくりと滴下します。次に、ピペットを使用して0.2%アリザリンレッドS溶液を90秒間ゆっくりと内皮に落とす前に、小さなガラスビーカーで0.9%塩化ナトリウムでボタンを慎重に3回リンスします。次に、サンプルをちょうど実証したようにイメージします。
細胞密度と形態評価のために画像を準備するには、適切なグラフィックス編集ソフトウェアプログラムで画像を開き、画像上に100マイクロメートルの真の横の長さの正方形を投影します。スケール バーをトリミングするには、長方形のマーキー ツールを使用して縮尺バーに境界線を設定し、[編集]を選択してトリミングします。[ファイル]および[新規作成]をクリックし、[クリップボード]を選択します。
他の画像に対応するピクセルをメモし、[OK] をクリックします。[ファイル] をクリックしてもう一度 [新規] をクリックし、スケール バーの長さに応じて、ポップアップ ウィンドウにカウントの正方形の幅と長さをピクセル単位で挿入します。背景色として白を選択し、[OK]をクリックしてすべてを選択し、選択したイメージをコピーします。角膜内皮の画像を選択し、角膜内皮に正方形を貼り付けます。
正方形のレイヤーを選択し、不透明度を 30% に設定してから[OK]をクリックし、100 マイクロメートルの実際からスケールまでのスライド長を持つ投影された正方形で画像を保存します。内皮細胞密度を評価するには、ImageJ で投影された正方形で画像を開き、セルカウンタープラグインを開きます。四角形内のセルをカウントするには、[初期化] をクリックして四角形の両側の内皮セルをカウントし、結果を記録します。
形態学的パラメータを評価するには、セルの境界あたり少なくとも4つのセルの合同会議、特徴的なロゼット形の外観、および投影された正方形内のアリザリンレッド領域を数えます。15日間にわたり、分割角膜ボタンは内皮細胞密度の着実な減少を示し、15日目の内皮細胞層の平均週%内皮細胞損失は4.90%染色され、角膜細胞の形態学的分析が可能になり、変形数値は合併細胞境界の約7%を占め、約100%のバラバラ形成の中央値が形成された、およびミリメートル当たり約13時間の細胞損失が2乗。ここで、低張性バランス塩溶液における顕微鏡評価時の角膜内皮の代表的な画像、およびトリパンブルーおよびアリザリンレッドSで染色した後、観察することができる。
分割角膜ボタンを下向きにして内皮側を下にして栽培すると、広範な内皮細胞損傷が予想される。非分割角膜ボタンは、間質腫脹による内皮細胞喪失が有意に増加し、15日間にわたる培養のデスセメットの膜折りたたみを引き起こすのに対し、分割角膜ボタンは、散乱した時間厳守アリザリン赤染色領域によって証明されるように、15日間の培養後に大部分が保存された角膜内皮を示す。細胞の損失を最小限に抑えるために、このプロトコルの任意のステップを通して角膜内皮に触れないように注意する必要があります。
