Este protocolo presenta el primer modelo de investigación que permite el cultivo organotípico a largo plazo de células endoteliales corneales logradas con la preparación de botones corneales divididos. Al eliminar parcialmente las capas corneales externas, la pérdida de células endoteliales se reduce significativamente, permitiendo el cultivo de células endoteliales corneales durante al menos 15 días. Por lo tanto, este modelo es valioso para investigar los efectos de sustancias o técnicas de interés específicas como soluciones de riego o dispositivos viscoelásticos oftálmicos en el endotelio corneal.
Después de recibir ojos de cerdo que fueron retirados poco post-mortem, use tijeras para los ojos y fórceps Colibri para eliminar todos los adnexes orbitales. Coloque de cinco a seis ojos en una solución PBS de cinco por ciento durante un total de cinco minutos para desinfectar adecuadamente las superficies oculares, con una agitación cuidadosa una vez por minuto para asegurarse de que las superficies estén completamente sumergidas para lograr una desinfección completa. Después de cinco minutos, transfiera los ojos desinfectados a una taza de PBS puro y revuelva cuidadosamente para lavar a fondo la solución de yodo PBS de las superficies oculares.
Antes de comenzar la disección, utilice un catéter contundente para llenar una jeringa de cinco mililitros con dos mililitros de suero de pantorrilla fetal recién descongelado, y colar el suero a través de un filtro de 0,22 micrómetros en 80 mililitros de medio de cultivo libre de dextrano. Agitar suavemente la mezcla para lograr una distribución homogénea del suero, y añadir tres mililitros del medio a cada pozo de una placa de cultivo celular de 12 pozos. Cuando la placa esté lista, transfiera un bulbo ocular a un soporte de bulbo ocular bajo un microscopio quirúrgico oftálmico con la córnea hacia arriba, y utilice una jeringa llena de cloruro de sodio al 0,9% para aplicar una ligera succión al ojo sobre el soporte del bulbo ocular para fijar el ojo en su lugar.
Utilice una treptina que contenga una incrustación estandarizada para cortar superficialmente en la córnea central, no más de 300 micrómetros, y utilice fórceps Colibri y un bisturí de un solo uso con una hoja triangular para cortar y eliminar el fragmento parcialmente trefinado de la córnea horizontalmente a través del estroma. Coloque superficialmente una sutura 10-0 en el estroma para permitir la diferenciación del endotelial del lado estromal durante los experimentos, sin penetrar el endotelio corneal, y utilice una tretina sin incrustación para avanzar el corte de la tretina a toda la profundidad hasta que se alcance la cámara ocular anterior. Una clara caída en la resistencia y fuga de líquido de la cámara ocular anterior se puede percibir después de la penetración completa de la córnea.
Coloque el botón corneal dividido obtenido que contiene parte del estroma, la membrana del Descemet y el endotelio corneal en un pozo de la placa de 12 pozos con el lado etiquetado hacia abajo. A continuación, etiquete cada pozo en la placa de cultivo con un número individual para cada botón corneal dividido para su identificación durante los seguimientos. Cuando se hayan recogido todos los botones corneales, coloque la placa de 12 pocillos en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono y 95% de humedad, reemplazando el sobrenadante el día ocho si se supera un período de incubación de siete días.
Para realizar un examen no realizado, agregue tres mililitros de solución de sal balanceada hipotónica a cada pozo de una placa de 12 pozos, y coloque cuidadosamente un solo botón corneal dividido en cada pozo para inducir la hinchazón de las células endoteliales corneales, y para mejorar la visibilidad de las células para el recuento. Después de uno a dos minutos, utilice una cámara de microscopio para adquirir al menos tres imágenes de tres áreas diferentes del endotelio para obtener una impresión representativa de la condición real del endotelio corneal, y agregue una barra de escala con la longitud real a escala de 100 micrómetros para su análisis posterior. Para evitar daños osmóticos, transfiera el botón corneal dividido de la solución después de un máximo de cinco minutos de vuelta al medio de cultivo.
Para realizar un examen manchado, coloque los botones corneales divididos en platos individuales de Petri, endotelial hacia arriba, y use una pipeta para dejar caer lentamente 0.25%Trypam solución azul en cada endotelio corneal durante 90 segundos por espécimen. A continuación, enjuague cuidadosamente los botones tres veces en cloruro de sodio al 0,9% en un vaso de precipitados de vidrio pequeño antes de usar una pipeta para dejar caer lentamente la solución de Alizarin Red S sobre la endotelia durante 90 segundos. A continuación, imagine las muestras como se acaba de demostrar.
Para preparar las imágenes para la evaluación de la densidad celular y la morfología, abra las imágenes en un programa de software de edición de gráficos adecuado y proyecte un cuadrado con una longitud lateral real a escala de 100 micrómetros en la imagen. Para recortar la barra de escala, utilice la herramienta de marco rectangular para bordear la barra de escala y seleccionar editar y recortar. Haga clic en archivo y nuevo y seleccione portapapeles.
Anote los píxeles correspondientes para las otras imágenes y haga clic en Aceptar. Haga clic en archivo y nuevo de nuevo, e inserte el ancho y la longitud del cuadrado de recuento en píxeles en la ventana emergente según la longitud de la barra de escala. Seleccione blanco como color de fondo y haga clic en Aceptar para seleccionar todo y copie la imagen seleccionada. Seleccione la imagen del endotelio corneal y pegue el cuadrado en el endotelio corneal.
Seleccione la capa cuadrada y establezca la opacidad en 30%Luego haga clic en Aceptar y guarde la imagen con el cuadrado proyectado con la longitud de diapositiva verdadera a escala de 100 micrómetros. Para evaluar la densidad de celdas endoteliales, abra las imágenes con los cuadrados proyectados en ImageJ y abra el complemento de contador de celdas. Para contar las celdas dentro del cuadrado, haga clic en inicializar para contar las celdas endoteliales en dos lados del cuadrado y registrar el resultado.
Para evaluar los parámetros morfológicos, cuente la reunión conjunta de al menos cuatro celdas por borde celular, la apariencia característica en forma de roseta y las áreas rojas de Alizarin dentro de los cuadrados proyectados. Durante un período de 15 días, los botones de córnea divididos demuestran una disminución constante de la densidad celular endotelial, con un porcentaje promedio semanal de pérdida de células endoteliales de 4.90%La tinción de la capa celular endotelial en el día 15 permite el análisis morfológico de las células corneales, con cifras de reforma que representan aproximadamente el siete por ciento de los bordes celulares de fusión, una mediana de aproximadamente una , y alrededor de 13 pérdidas de células puntuales por milímetro al cuadrado. Aquí, se pueden observar imágenes representativas del endotelio corneal durante la evaluación microscópica en solución de sal balanceada hipotónica, y después de la tinción con azul Trypan y Alizarin Red S.
Si los botones corneales divididos se cultivan con el lado endotelial hacia abajo, se espera un daño extenso de las células endoteliales. Los botones corneales no divididos sufren una pérdida significativa de células endoteliales debido a la hinchazón estromal, lo que provoca el plegado de membrana de Descemet durante 15 días de cultivo, mientras que los botones corneales divididos exhiben un endotelio corneal en gran parte preservado después de 15 días de cultivo, como lo demuestran las áreas dispersas de Alizarin Red, indicativas de células destrucción única. Para minimizar la pérdida celular, se debe tener cuidado de no tocar el endotelio corneal a lo largo de cualquier paso de este protocolo.
