Este protocolo apresenta o primeiro modelo de pesquisa que permite o cultivo organotípico a longo prazo de células endoteliais córneas alcançadas com a preparação de botões de córneas divididos. Ao remover parcialmente as camadas da córnea externa, a perda de células endoteliais é significativamente reduzida, permitindo o cultivo de células endoteliais córneas por pelo menos 15 dias. Portanto, este modelo é valioso para investigar os efeitos de substâncias ou técnicas específicas de interesse, como soluções de irrigação ou dispositivos viscoelásticos oftálmicos no endotélio córnea.
Depois de receber olhos de porco que foram removidos logo após a morte, use tesouras oculares e fórceps colibri para remover todos os adnexes orbitais. Coloque de cinco a seis olhos em uma solução PBS de 5% de iodo por um total de cinco minutos para desinfetar adequadamente as superfícies dos olhos, com agitação cuidadosa uma vez por minuto para garantir que as superfícies estejam totalmente submersas para alcançar uma completa desinfecção. Após cinco minutos, transfira os olhos desinfetados para uma xícara de PBS puro, e mexa cuidadosamente para lavar cuidadosamente a solução pbs de iodo das superfícies dos olhos.
Antes de iniciar a dissecção, use um cateter contundente para encher uma seringa de cinco mililitros com dois mililitros de soro de bezerro fetal recém-descongelado, e coe o soro através de um filtro de 0,22 micrômetros em 80 mililitros de meio de cultura livre de dextran. Agitar suavemente a mistura para obter uma distribuição homogênea do soro, e adicionar três mililitros do meio a cada poço de uma placa de cultura celular de 12 poços. Quando a placa estiver pronta, transfira uma lâmpada ocular para um suporte de lâmpada ocular sob um microscópio cirúrgico oftálmico com a córnea voltada para cima, e use uma seringa cheia com cloreto de sódio de 0,9% para aplicar uma leve sucção ao olho sobre o suporte da lâmpada ocular para fixar o olho no lugar.
Use uma trefina contendo uma inlay padronizada para cortar superficialmente na córnea central, não mais profunda que 300 micrômetros, e use fórceps colibri e um bisturi de uso único com uma lâmina triangular para cortar e remover o fragmento parcialmente trefiado da córnea horizontalmente através do estroma. Superficialmente coloque uma sutura de 10-0 no estroma para permitir a diferenciação do endotelial do lado estromal durante os experimentos, sem penetrar no endotélio córnea, e use uma trefina sem uma incrustação para avançar o corte de trefina até que a câmara de olhos anterior seja atingida. Uma queda distinta na resistência e vazamento de fluido da câmara ocular anterior pode ser percebida após a penetração completa da córnea.
Coloque o botão de córnea dividido obtido contendo parte do estroma, a membrana do Descemet e o endotélio córnea em um poço da placa de 12 poços com o lado marcado voltado para baixo. Em seguida, rotule cada poço na placa de cultura com um número individual para cada botão de córnea dividido para identificação durante os acompanhamentos. Quando todos os botões de córnea forem coletados, coloque a placa de 12 poços em uma incubadora de cultura celular a 37 graus celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade, substituindo o supernascido no oitavo dia se um período de incubação de sete dias for excedido.
Para realizar um exame não realizado, adicione três mililitros de solução de sal hipotônico balanceado para cada poço de uma placa de 12 poços, e coloque cuidadosamente um único botão de córnea dividido em cada poço para induzir o inchaço das células endoteliais da córnea, e para melhorar a visibilidade das células para contagem. Após um a dois minutos, use uma câmera de microscópio para adquirir pelo menos três imagens de três áreas diferentes do endotélio para obter uma impressão representativa da condição real do endotélio córnea, e adicionar uma barra de escala com o comprimento real em escala de 100 micrômetros para análise posterior. Para evitar danos osmóticos, transfira o botão córnea dividido da solução após um máximo de cinco minutos de volta para o meio de cultura.
Para realizar um exame manchado, coloque os botões de córnea divididos em placas de Petri individuais, lado endotelial para cima, e use uma pipeta para soltar lentamente 0,25% solução azul trypam em cada endotélio córnea por 90 segundos por espécime. Em seguida, enxágue cuidadosamente os botões três vezes em cloreto de sódio de 0,9% em um pequeno copo de vidro antes de usar uma pipeta para soltar lentamente 0,2% solução Alizarin Red S na endotélia por 90 segundos. Em seguida, imagine as amostras como apenas demonstrado.
Para preparar as imagens para avaliação da densidade celular e morfologia, abra as imagens em um programa de software de edição gráfica apropriado e projete um quadrado com um comprimento lateral de 100 micrômetros na imagem. Para cortar a barra de escala, use a ferramenta de letreiro retangular para bordar a barra de escala e selecionar edição e cultura. Clique em arquivo e novo e selecione área de transferência.
Observe os pixels correspondentes para as outras fotos e clique em OK. Clique em arquivo e novo novamente, e insira a largura e o comprimento do quadrado de contagem em pixels na janela pop-up de acordo com o comprimento da barra de escala. Selecione o branco como uma cor de fundo e clique em OK para selecionar tudo e copie a imagem selecionada. Selecione a imagem do endotélio córnea e cole o quadrado no endotélio da córnea.
Selecione a camada quadrada e defina a opacidade em 30%Em seguida, clique em OK e salve a imagem com o quadrado projetado com o comprimento de slide real-em escala de 100 micrômetros. Para avaliar a densidade celular endotelial, abra as imagens com os quadrados projetados no ImageJ e abra o plugin do contador de células. Para contar as células dentro do quadrado, clique inicializar para contar as células endoteliais em dois lados do quadrado, e registrar o resultado.
Para avaliar os parâmetros morfológicos, conte a reunião conjunta de pelo menos quatro células por borda celular, a aparência característica em forma de roseta, e as áreas vermelhas de Alizarin dentro dos quadrados projetados. Durante um período de 15 dias, botões de córneas divididos demonstram um declínio constante na densidade celular endotelial, com uma perda média semanal de células endoteliais de 4,90% A coloração da camada celular endotelial no dia 15 permite a análise morfológica das células córneas, com números de reforma representando aproximadamente sete por cento das bordas celulares merging, uma mediana de aproximadamente uma formação de rosette por milímetro , e cerca de 13 perdas celulares pontuais por milímetro ao quadrado. Aqui, podem ser observadas imagens representativas do endotélio córnea durante a avaliação microscópica em solução de sal balanceado hipotônico, e após a coloração com azul Trypan e Alizarin Red S, podem ser observadas.
Se os botões de córneas divididos forem cultivados com o lado endotelial voltado para baixo, é esperado um extenso dano celular endotelial. Os botões de córnea não divididos sofrem uma perda de células endoteliais significativamente aumentada devido ao inchaço estromal, causando a dobra da membrana de Descemet ao longo de 15 dias de cultivo, enquanto os botões de córneas divididos exibem um endotélio córnea amplamente preservado após 15 dias de cultivo, como evidenciado por áreas manchadas de vermelho alizarinas espalhadas, indicativo de células destruídas únicas. Para minimizar a perda celular, deve-se tomar cuidado para não tocar no endotélio córnea ao longo de qualquer etapa deste protocolo.
