이 프로토콜은 분할 각막 버튼의 준비로 달성 각막 내피 세포의 장기 전형 장기 재배를 허용하는 첫 번째 연구 모델을 제시한다. 외부 각막 층을 부분적으로 제거함으로써 내피 세포 손실이 현저히 감소되어 적어도 15일 동안 각막 내피 세포의 재배를 허용합니다. 따라서, 이 모델은 각막 내시경에 관개 솔루션 또는 안과 점탄성 장치와 같은 관심있는 특정 물질 또는 기술의 효과를 조사하는 데 유용합니다.
모템 직후 제거된 돼지 눈을 받은 후, 눈 가위와 대장균 집게를 사용하여 모든 궤도 사전을 제거합니다. 5~6개의 눈을 5% 요오드 PBS 용액에 넣고 총 5분 동안 눈 표면을 제대로 소독하고, 1분에 한 번주의 깊게 저어서 표면이 완전히 침수되어 완전한 소독을 달성합니다. 5분 후, 소독된 눈을 순수한 PBS 한 잔으로 옮기고, 조심스럽게 저어요오드 PBS 용액을 눈 표면에서 철저히 씻어냅니다.
해부를 시작하기 전에 무딘 카테터를 사용하여 5 밀리리터 주사기를 5 밀리리터의 갓 해동한 태아 종아리 혈청 2밀리리터를 채우고 0.22 마이크로미터 필터를 통해 30밀리리터의 도민을 데센이 없는 배양 배지의 80밀리리터로 변형시니다. 혼합물을 부드럽게 교반하여 혈청의 균질 분포를 달성하고, 12웰 세포 배양판의 각 웰에 3밀리리터를 첨가한다. 플레이트가 준비되면 각막이 위향인 안과 수술 현미경으로 안구 홀더로 눈 전구를 옮기고, 0.9%의 염화나트륨으로 채워진 주사기를 사용하여 눈위에 약간의 흡입을 적용하여 눈을 고정시합니다.
표준화된 인레이가 들어 있는 트레핀을 사용하여 중앙 각막으로 피상적으로 절단하고 300 마이크로미터 이하의 더 깊은 것을 방지하고, 삼각 블레이드가 있는 대장균 집게와 일회용 메스를 사용하여 각막의 부분적으로 트레핀화된 조각을 스트로마를 가로로 잘라내고 제거합니다. 표면적으로 10-0 봉합사를 스트로마에 배치하여 실험 중에 기질 측으로부터 내피의 분화를 허용하고, 각막 내피를 관통하지 않고, 전방 눈챔버에 도달할 때까지 트레핀 컷을 전체 깊이로 전진시키기 위해 인레이없이 트레핀을 사용합니다. 전방 눈 챔버에서 누출되는 저항과 유체의 뚜렷한 낙하는 각막의 완전한 침투 후에 인식될 수 있습니다.
스트로마의 일부를 포함하는 획득한 분할 각막 버튼, 데스멧의 멤브레인, 각막 내막을 태그된 면이 아래로 향하여 12웰 플레이트의 한 우물에 놓습니다. 그런 다음 후속 조치 중 식별을 위해 모든 분할 각막 버튼에 대한 개별 번호로 문화 판에 각 우물에 레이블을 지정합니다. 각막 버튼이 모두 수집되면, 세포 배양 인큐베이터에 12웰 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 배치하여 7일 배양 기간을 초과하는 경우 8일째에 상퍼를 교체한다.
스테인드 검사를 수행하기 위해, 12 웰 플레이트의 각 웰에 저혈압 균형 소금 용액의 3 밀리리터를 추가하고 각 웰에 단일 분할 각막 버튼을 신중하게 배치하여 각막 내피 세포의 붓기를 유도하고 계산을위한 세포의 가시성을 향상시킵니다. 1 내지 2분 후, 현미경 카메라를 사용하여 내피의 3개 영역의 적어도 3개의 이미지를 획득하여 각막 내피의 실제 상태를 대표하는 인상을 얻고, 나중에 분석을 위해 100 마이크로미터의 실제 길이로 스케일 바를 추가한다. 삼투압 손상을 방지하기 위해 분할 각막 버튼을 최대 5분 후에 용액에서 배양 매체로 다시 전송합니다.
스테인드 검사를 수행하기 위해, 개별 페트리 접시에 분할 각막 버튼을 배치, 내피 측 위로, 천천히 0.25 %의 Trypam 블루 용액을 각 각막 내피에 드롭 표본 당 90 초. 다음으로, 피펫을 사용하기 전에 작은 유리 비커에 0.9%의 염화 나트륨으로 버튼을 세 번 조심스럽게 헹구고 0.2%의 알리자린 레드 S 용액을 내도벨리아에 90초 간 천천히 떨어뜨립니다. 그런 다음 방금 설명한 대로 샘플을 이미지화합니다.
세포 밀도 및 형태 학적 평가를 위한 이미지를 준비하려면 적절한 그래픽 편집 소프트웨어 프로그램에서 이미지를 열고 이미지에 100 마이크로미터의 실제 측면 길이로 사각형을 투영합니다. 축척 막대를 자르려면 직사각형 선택 윤곽 도구를 사용하여 축척 막대와 경계를 맞정하고 편집 및 자르기를 선택합니다. 파일과 새 파일을 클릭하고 클립보드를 선택합니다.
다른 사진에 대한 해당 픽셀을 기록하고 확인을 클릭합니다. 파일과 새 파일을 다시 클릭하고 스케일 표시줄의 길이에 따라 팝업 창의 픽셀에 카운팅 사각형의 너비와 길이를 삽입합니다. 흰색을 배경색으로 선택하고 확인을 클릭하여 모두 선택하고 선택한 이미지를 복사합니다. 각막 내막 의 이미지를 선택하고 각막 내막에 사각형을 붙여 넣습니다.
정사각형 레이어를 선택하고 불투명도를 30%로 설정한 다음 확인을 클릭하고 100 마이크로미터의 실제 슬라이드 길이로 투영된 사각형으로 이미지를 저장합니다. 내피 세포 밀도를 평가하려면 ImageJ에서 투영 된 사각형으로 이미지를 열고 셀 카운터 플러그인을 엽니 다. 사각형 내의 셀을 계산하려면 초기화를 클릭하여 사각형의 양면에 내피 세포를 계산하고 결과를 기록합니다.
형태학적 매개 변수를 평가하기 위해 셀 테두리당 적어도 4개의 세포의 관절 회의, 특징적인 로제트 모양, 및 투영된 사각형 내에서 Alizarin Red 영역을 계산합니다. 15일 동안 분할 각막 버튼은 내피 세포 밀도가 꾸준히 감소하는 것으로 나타났으며, 15일째에 내피 세포 층의 평균 주간 백분율 내피 세포 손실4.90%의 염색으로 각막 세포의 형태학적 분석을 허용하며, 약 7%의 암조 세포 면적을 차지하는 개혁 수치가 약 1제곱미터의 중간 체형을 구성할 수 있습니다. , 밀리미터 당 약 13 정시 세포 손실제곱. 여기서, 저혈압 균형 소금 용액에서 현미경 평가 시 각막 내피의 대표적인 이미지를 관찰하고, 트라이판 블루 및 알리자린 레드 S로 염색한 후, 관찰될 수 있다.
분할 각막 버튼이 내피 측을 향하고 있는 것으로 재배되면 광범위한 내피 세포 손상이 예상됩니다. 비분할 각막 버튼은 기질 부종으로 인한 내피 세포 손실이 크게 증가하여 15일 동안 데세멧의 막이 접히는 반면, 분할 각막 버튼은 15일 간의 재배 후 크게 보존된 각막 내신생물을 나타내며, 이는 반소 천막 알리자린 레드-스테인드 부위에 의해 입증된 바와 같이 파괴되었다. 세포 손실을 최소화하기 위해 이 프로토콜의 모든 단계에서 각막 내신도를 만지지 않도록 주의를 기울여야 합니다.
