Этот протокол представляет собой первую исследовательскую модель, позволяющую органотипное долгосрочное культивирование эндотелиальных клеток роговицы, достигнутые с подготовкой кнопок расщепляется роговицы. Частично удаляя внешние слои роговицы, эндотелиальная потеря клеток значительно уменьшается, что позволяет выращивать эндотелиальные клетки роговицы, по крайней мере 15 дней. Таким образом, эта модель является ценным для изучения воздействия конкретных веществ или методов, представляющих интерес, таких как оросительные растворы или офтальмологические вискоэлестические устройства на эндотелий роговицы.
После получения свиных глаз, которые были удалены вскоре после смерти, использовать ножницы для глаз и Colibri типсы, чтобы удалить все орбитальные adnexes. Поместите пять-шесть глаз в пятипроцентный раствор йода PBS в общей сложности пять минут, чтобы должным образом дезинфицировать поверхности глаз, с тщательным перемешиванием один раз в минуту, чтобы убедиться, что поверхности полностью погружены для достижения полной дезинфекции. Через пять минут перенесите дезинфицированные глаза на чашку чистого PBS и тщательно перемешайте ее, чтобы тщательно вымыть раствор йода PBS с глазных поверхностей.
Перед началом вскрытия используйте тупой катетер, чтобы заполнить пятими миллилитровый шприц двумя миллилитров свежеоттаянной сыворотки теленка плода, и процедить сыворотку через 0,22 микрометрового фильтра в 80 миллилитров декстран-свободной среды культуры. Аккуратно агитировать смесь для достижения однородного распределения сыворотки, и добавить три миллилитров среды к каждому хорошо 12-хорошо пластины клеточной культуры. Когда пластина будет готова, передача глазной лампы в глазник под офтальмологическим хирургическим микроскопом с роговицей лицом вверх, и использовать шприц заполнены 0,9% хлорида натрия применять небольшое всасывание в глаза над держатель лампочки, чтобы исправить глаз на месте.
Используйте трефин, содержащий стандартизированный вставки, чтобы нарезать поверхностно в центральной роговицы, не глубже, чем 300 микрометров, и использовать Colibri типсов и одноразовый скальпель с треугольным лезвием, чтобы сократить и удалить частично трефинированный фрагмент роговицы горизонтально через строму. Поверхностно поместите 10-0 шва в строму, чтобы дифференциация эндотелиала от стромальной стороны во время экспериментов, не проникая в эндотелий роговицы, и использовать трефин без вставки для продвижения trephine вырезать на всю глубину, пока передняя камера глаза не будет достигнута. Явное падение резистентности и утечки жидкости из передней камеры глаза может быть воспринято после полного проникновения роговицы.
Поместите полученную кнопку роговицы, содержащую часть стромы, мембрану Десемета и эндотелий роговицы в один колодец пластины из 12 колодец с помеченной стороной лицом вниз. Затем отметь каждый хорошо на пластине культуры с индивидуальным номером для каждой кнопки раскол роговицы для идентификации во время последующих мер. Когда все кнопки роговицы были собраны, поместите 12-хорошо пластины в инкубаторе клеточной культуры на 37 градусов по Цельсию, пять процентов углекислого газа, и 95% влажности, заменив супернатант на восьмой день, если семидневный инкубационный период превышен.
Для выполнения неоплательянное обследование, добавить три миллилитров гипотонического сбалансированного соленого раствора для каждого хорошо 12-хорошо пластины, и тщательно поместите одну кнопку раскол роговицы в каждый хорошо, чтобы вызвать отек эндотелиальных клеток роговицы, и улучшить видимость клеток для подсчета. Через одну-две минуты используйте микроскопную камеру, чтобы получить по крайней мере три изображения трех различных областей эндотелия, чтобы получить репрезентативное впечатление о фактическом состоянии эндотелия роговицы, и добавить планку масштаба с реальной длиной 100 микрометров для более позднего анализа. Чтобы предотвратить осмотическое повреждение, перенесите кнопку расщепленного роговицы из раствора через максимум пять минут обратно в культурную среду.
Для выполнения окрашенных экспертизы, место раскол роговицы кнопки в отдельных чашках Петри, эндотелиальной стороне вверх, и использовать пипетку медленно падение 0,25%Trypam синий раствор на каждый роговицы эндотелия в течение 90 секунд на образец. Далее, тщательно промыть кнопки три раза в 0,9% хлорида натрия в небольшой стакан перед использованием пипетки медленно падение 0,2%Alizarin Red S раствор на эндотелии в течение 90 секунд. Затем изображение образцов, как только что продемонстрировали.
Чтобы подготовить изображения для оценки плотности клеток и морфологии, откройте изображения в соответствующей программе редактирования графики и проецируете квадрат с истинной длиной стороны 100 микрометров на изображении. Чтобы обрезать планку масштаба, используйте прямоугольный инструмент шатер, чтобы граничить с баром масштаба и выбрать редактировать и обрезать. Нажмите файл и новый, и выберите буфер обмена.
Обратите внимание на соответствующие пиксели для других изображений и нажмите OK. Нажмите файл и новый снова, и вставьте ширину и длину квадрата подсчета пикселей в всплывающем окне в зависимости от длины полосы масштаба. Выберите белый цвет в качестве фонового цвета и нажмите OK, чтобы выбрать все и скопировать выбранное изображение. Выберите изображение эндотелия роговицы и вставьте квадрат на эндотелий роговицы.
Выберите квадратный слой и установите непрозрачность до 30%, затем нажмите OK и сохраните изображение с прогнозируемым квадратом с истинной длиной слайда 100 микрометров. Чтобы оценить плотность эндотелиальных клеток, откройте изображения с проецируемыми квадратами в ImageJ и откройте плагин счетчика ячейки. Чтобы подсчитать ячейки в квадрате, нажмите инициализировать, чтобы подсчитать эндотелиальные ячейки с двух сторон квадрата и записать результат.
Для оценки морфологических параметров подсчитайте совместное собрание не менее четырех клеток на клеточной границе, характерный вид розетки и красные области Ализарин в пределах прогнозируемых квадратов. В течение 15 дней, разделенные кнопки роговицы демонстрируют устойчивое снижение плотности эндотелиальных клеток, со средним еженедельным процентом эндотелиальной потери клеток 4,90% Окрашивание эндотелиального клеточного слоя на 15-й день позволяет морфологический анализ клеток роговицы, с показателями реформирования, что составляет около семи процентов от слияния границ клеток, медиана примерно одного образования розетки на миллиметр на образец , и около 13 пунктуальных потерь клеток на миллиметр в квадрате. Здесь можно наблюдать репрезентативные изображения эндотелия роговицы во время микроскопической оценки в гипотоническом сбалансированном соляном растворе, а после окрашивания трипан-синим и ализарином Red S.
Если раскол роговицы кнопки культивируются с эндотелиальной стороны лицом вниз, обширные повреждения эндотелиальных клеток следует ожидать. Нераздвочные кнопки роговицы страдают значительно повышенной эндотелиальной потерей клеток из-за стромального отека, в результате чего мембрана Descemet складывается в течение 15 дней выращивания, в то время как разделенные кнопки роговицы демонстрируют в значительной степени сохранившийся эндотелий роговицы после 15 дней выращивания, о чем свидетельствует рассеянный пунктуальный Ализарин красно-окрашенных областях, что свидетельствует о одной разрушенной клетки. Чтобы свести к минимуму потерю клеток, следует позаботиться, чтобы не касаться эндотелия роговицы на протяжении всех этапов этого протокола.
