Yazarlar Ander Lopez ve Miren Telletxea yardım video kayıt ve düzenleme için kabul. ACR Ikerbasque arkadaş grubu ve bir araştırma projesi Asociación de Celiacos Madrid (ACM) tarafından finanse edilmektedir. JRB proje ISCIII-PI16/00258 tarafından finanse edilen ve Avrupa Birliği ERDF/ESF tarafından "Avrupa nın yolunu" ortak finanse. Bu bir araştırma projesi hibe Bask Sağlık Bakanlığı tarafından 2015111068 finanse edilmektedir. IRG ve AJM HGUGM bursu hibe UPV/EHU ve Bask Department of Education, sırasıyla destekler.

Bu çalışmada Cruces Üniversitesi Hastane etik kurulu tarafından kabul edildi ve aydınlatılmış onam tüm konular ya da aileleri elde sonra analizleri gerçekleştirilmiştir.
1. biyopsi koleksiyonu
Not: Biyopsi örnekleri hastaların distal duodenum dan bu aralıktaki arasında 2 ve 10 mg kilo biyopsi yönetme rutin tanı endoskopi sırasında elde edilir. Biyopsi doku, bağışıklık epitel ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre türleri oluşan karmaşık bir dokudur. Klinik gastroenterologlar endoskopi gerçekleştirmek aşağıdaki kurulan klinik yönergeleri.
<ol><li>Biyopsi endoskopi sonra steril bir filtre kağıdı yerleştirin.</li>
	<li>Forseps biyopsi 1,5 mL tüpler transfer için PBS ile ıslatın ve bir cryotube koyun kullanın.</li>
	<li>Laboratuarda gelene tüpler buz üzerinde tutun.<ol>
<li>Taze biyopsileri hemen işleme başlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Donmuş biyopsileri, flaş tüpler içeren biyopsi donma ve sıvı azot kadar kullanmak saklarız. Not: Soğuk desteklenmiştir arabellek 1 eklenene kadar donmuş örnek tutmak önemlidir.</li>
</ol>2. arabellek hazırlık
Not: başlamadan önce arabellekleri aşağıdaki gibi ek.
<ol><li>1 mM DTT (son konsantrasyonu) ekleyin ve proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl (1 son konsantrasyonu x) 1 ve hipertonik hipotonik tampon tampon 2 (Tablo 1).<ol>
<li>Arabellek 1 ve 150 µL arabelleğinin 2 örnek başına 1,5 mL hazırlayın. DTT örnekleri oksidasyonunu engeller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çekirdeklerin yıkama arabellek % 1 deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ekleyerek zaten desteklenmiştir arabelleğine %1 0.1 son bir konsantrasyon için hazır olun. 1 mL örnek başına çekirdek yıkama tamponunun hazırlayın.</li>
</ol>3. biyopsi homojenizasyon
<ol><li>
Taze biyopsi
	<ol>
<li>Tek kullanımlık havaneli motorlu Mikser yerleştirin. Havaneli tüp alt ulaştığından emin olmak.</li>
		<li>Biyopsi cryotube çıkar ve bir pipet ucu ile 1,5 mL tüp yerleştirebilirsiniz.</li>
		<li>200 µL desteklenmiştir arabelleği 1 1,5 mL tüp ekleyin.</li>
		<li>Doku tamamen bozulur kadar biyopsi havaneli ile homojenize ve buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Bir kez tüm biyopsiler homojenize adım 4 ile devam edin. Not: Tek kullanımlık dibekler biyopsi arasında değiştirilmesi gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Donmuş biyopsi Dikkat: sıvı azot dikkatle ele; sıvı azot ile cilt veya gözlerle temas ciddi donma yaralanmalara neden olabilir. Eller ve gözler her zaman sıvı azot ile çalışırken korumak.<ol>
<li>Bazı sıvı azot azot tankından alındı cryotubes depolamak için bir kutu almak.</li>
		<li>Biyopsi azot depoda bulun ve sıvı azot ile kutusunda cryotube takın. Biyopsi için bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Biyopsi cryotube 1.5 mL tüp aktarın. Not: Biyopsi için dondurulmuş Tüp bağlı olacak. Tüm tüpünden ayırarak biyopsiyi steril pipet ucu ile itmek.</li>
		<li>200 µL desteklenmiştir arabelleği 1 ekleyin.</li>
		<li>Doku havaneli ve harç doku tamamen bozulur kadar kullanarak, tüm prosedürü boyunca 4 ° C sıcaklıkta muhafaza lunaparkçı. Not: arabellek eklemeden önce çözülme biyopsi izin vermeyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. sitoplazma yalıtım
<ol><li>10 dakika buzda homojenize biyopsi kuluçkaya.</li>
	<li>Her örnek % 0.05 son bir konsantrasyon için 10 µL % 1 deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ekleyin. Not: Hücreleri şişmeye ve hafif deterjan hücre zarı bozabilir olacaktır gibi ozmotik lizis tarafından patladı.</li>
	<li>Buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya.</li>
	<li>Kısaca girdap ve 2 min için 4 ˚C'de 400 x g, santrifüj.</li>
	<li>Vortexing sonra süpernatant kaldırmak ve yeni bir temiz 1.5 mL tüp transferi; Bu sitoplazmik kesir olacak. Pelet atmayın.</li>
</ol>5. nükleer yalıtım
<ol><li>Pelet 200 µL çekirdeği yıkama arabelleği ile önceki adımdaki resuspend.</li>
	<li>Tüp 400 x g ve 4 ° c de 2 dk santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant atın ve iki kez daha çamaşır yordamı yineleyin. Not: Yıkar nükleer kesir sitoplazmik kirlenme kaldırmak olacaktır.</li>
	<li>Sonra üçüncü yıkama, Pelet arabellek 2 100 µL içinde resuspend.</li>
	<li>Örnek 4 ˚C 30 dakika süreyle, alternatif olarak shake şiddetle, örnek buz ve girdap her 5 dk üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Sallayarak sonra örnek üst hızda 10 dk santrifüj kapasitesi (> 12.000 x g) ve 4 ° c</li>
	<li>Vortexing sonra yeni bir temiz 1.5 süpernatant aktarın. mL tüp. Bu nükleer kesir olacak.</li>
</ol>6. protein miktar
Not: bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil kiti ile proteinler ölçmek. Kesirler proteinlerin konsantrasyonu 0.5 ve 5 µg/µL, nükleer kesir daha düşük olma arasındaki aralığı olacaktır (bkz. protein konsantrasyonları 2 mg biyopsi sonuç için Tablo 2 ).
<ol><li>Aşağıdaki Sığır serum albumin (BSA) tutarların (µg)12ile standart bir eğri hazırlamak: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Son BCA Mix örnek başına 100 µL kullanmak için gerekli reaktifler hazırlayın.</li>
	<li>Her protein fraksiyonu 96 iyi plaka 2 µL pipet, BCA karışımı ekleyin ve okumak için üreticinin yönergelerini izleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokolü bağırsak biyopsisi nükleer ve sitoplazmik ayırma için kullanılır. Saf protein denatüre değil ve sadece Şekil 2 ve 3 ' te ama aynı zamanda immunoprecipitation, elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan) gibi yerli katlanmış proteinlerin gerektiren deneyleri içinde gösterildiği gibi Batı leke analiz kullanılabilir veya yerli polyacrylamide jel elektroforez (sayfa).
Açıklanan yöntemi il...

Bir hücre içinde hemen hemen tüm biyolojik fonksiyonları proteinler katılmak ve herhangi bir varyasyon kendi yapısı, miktar veya konumu patojenik bir senaryo için neden olabilir. Doku örneği ayırma yöntemleri çoğu hastalık karmaşıklığını azaltmak için yararlı bir yaklaşım ile ilgili protein analizleri. Bazı çalışmalarda protein yerelleştirme bilgileri kullanın veya belirli bir hücresel bölme bir protein olduğu gibi proteinlerin tekrarlanabilir ayırma için bir protokol biyolojik bazı soruları cevaplamak yararlı bu yüzden zenginleştirmek. Proteinlerin hücre altı yerelleştirme belirleme ve kendi compartmental yeniden dağıtım veya etkileşimler, bazal izleme ve hastalık koşulları hastalığı tanımlamak yardımcı olacak ilgili işlevsel farklılıklar1,2. Bu nedenle, bu yöntem tekrarlanarak bağırsak doku biyopsisi, taze ve donmuş, sitoplazmik ve nükleer hücre altı bölmeleri içine fractionate amaçlamaktadır.
Bağırsak biyopsisi örnekleri rutin olarak endoskopi işlemleri3 sırasında (Şekil 1) elde edilen ve etkin bir şekilde protein miktar veya immunoprecipitation çalışmalar için kullanılabilir. Epitel doku örnekleri bağırsak üzerinden doğrudan hastalık patogenezinde4' te tutulabilir proteinler içerdiğinden, bağırsak biyopsisi bağırsak hastalığa özgü başarılı tanımlanması için çok değerli bir kaynak olduğu proteinler. Saklı donmuş, hasta doku örnekleri klinik bilgilerinin yanı sıra protein analizi için yararlı kaynak vardır ve bir basit ve tekrarlanabilir numune hazırlama sınırlayıcı miktarda kullanarak hücre compartmental bilgileri sağlamak için önemli bir konudur dondurulmuş doku5.
Hücresel kesirler ayrılması için birkaç piyasada kitleri vardır, ama bunlar daha pahalı ve genellikle daha fazla zaman alıcı burada sunulan protokolü daha. Birden fazla adımlı degrade Santrifüjü protokolleri temel ve sürekli degradeler da daha önce farklı dokuların6,7farklı hücresel kompartmanlarda ayırma için kullanılmıştır. Ancak, sürekli degradeler tutarlılığını sağlamak kez zor bir iştir. Membranlar sıralı lizis üzerinde dayalı benzer iletişim kuralları daha önce tarif var ama onlar genellikle ikiden fazla arabellekleri ve gerekir zaman ellerde uzun8 .
Doku örnekleri parçalanması zaman, o doku protein ayıklama için devam zaman kültürlü hücreleri mevcut hem önemli örnekleri mevcut hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri unutmayın. Hücreleri ve hücre dışı matriks protein kalitesini etkilemeden arasında uygun arıza bağırsak dokusu protein yalıtım9kritik bir etken olacaktır. Bu protokol için hücre-hücre ve hücre-matris kişiler ilk kırık, hücreleri serbest ve tek tek hücreler ulaşmak için tampon izin vardır. Protein-yuvası ayırma önce karıştırma önlemek için kişileri dökümünü hücreleri veya nükleer membran bütünlüğü değiştirmeden bulunması gerekir.
Bağırsak mukoza10çeşitli proteaz zenginleştirme nedeniyle, protein yıkımı ayıklama sırasında kontrol etmek önemlidir. Potansiyel protein yıkımı en aza indirmek için birden çok proteaz inhibitörü protein ayıklama arabellekleri içinde dahil edilmesi gerekir. Ayrıca, özleri fonksiyonel deneyleri için kullanılmak üzere kullanacaksanız, bu protein etkinliği11kaybına neden olur gibi proteinler veya proteolizis denatürasyon önlemek önemlidir. Bu amaçla, protokol 4 ° C'de gerçekleştirilir ve taze phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) 0.1 mM daha fazla proteolizis etkisizleştirmek için kullanmak için sadece önceki son bir konsantrasyon, arabellekleri eklenir.
İlk hücre ayırma doku bozulması ve hücre lizis adımıdır. Daha önce de belirtildiği gibi hücreler ve onları en az hasar ile açık kırıldığını disaggregate hedefidir. Bağırsak doku örnekleri homojenize gerekir ve hücreleri hücre zarı maksimum kırılma elde etmek için lysed. Bu protokol için saniye içinde yüksek hızlı vortexing eylem yoluyla homojenize bağırsak dokusu kırmak için bir motorlu havaneli karıştırıcı kullanın. Homojenizasyon sonra doku hücreleri hücre zarı patlama olacak ama çekirdeklerin olduğu gibi bir sigara denaturing deterjan (nonil phenoxypolyethoxylethanol) ve çekirdekleri ayırmak için kısa bir girdap eklenmesi tarafından takip devam edecek hipotonik, arabellek içinde inkübe sitoplazmik kesir. Sitoplazma kaldırıldıktan sonra sallayarak ile hipertonik bir arabellek içine hücre çekirdek zarı patladı.
Burada sunulan yöntemi endoskopik yordamlar ve Aralık içinde ağırlık 2 ve 10 mg arasında sırasında elde edilen taze ve donmuş bağırsak biyopsisi hücre altı ayırma için uygun bir yöntemdir. İletişim kuralı kolay ve tekrarlanabilir ve temel laboratuvar donatım ve bir saat içinde reaktifler kullanarak gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase and phosphatase inhibitors</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Protein quantification kit</td></tr><tr><td>Disposable plastic pestles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogeneizer</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

Bu iletişim kuralının amacı insan bağırsak dokusu tarafından endoskopi yerelleştirme analizi için nükleer ve sitoplazmik bölmeleri spesifik proteinlerin veya protein kompleksleri (Yani, sağlıklı farklı doku Birleşik Devletleri içine elde edilen fractionate etmektir hastalığı) vs . Bu yöntem her iki taze ve donmuş bağırsak doku örneği ayırma için yararlıdır; Tüm laboratuarlar için kolayca erişilebilir ve zaman alıcı.

Şekil 1 bir hematoksilen eozin boyama sağlam villus ve mezar yapıları ile bir bağırsak biyopsisi bölümünün gösterir.
Bu iletişim kuralını kullanan nükleer ve sitoplazmik ayırma temsilcisi sonuçları rakamlar 2 ve 3' te gösterilmiştir. Şekil 2, bir taze (Fh) ve dondurulmuş (Fz) gösterilen deneyinde biyopsi aynı and...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Burada, insan taze ve donmuş bağırsak biyopsisi sitoplazmik ve nükleer proteinlerin hücre altı ayrılması için basit bir hücresel ayırma gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Taze ve donmuş Gastrointestinal örnekleri üzerinden hücre altı ayırma

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

An Overview of the Gastrointestinal System: Anatomy, Physiology, and Assessment

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Görüntüleme.  University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute. Burada, insan taze ve donmuş bağırsak biyopsisi sitoplazmik ve nükleer proteinlerin hücre altı ayrılması için basit bir hücresel ayırma gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Gelişim Biyolojisi

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Biyokimya

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused on bulk approaches that led to the molecular classification of brain tumors. Over the last five years, single cell sequencing approaches have highlighted several important features of gliomas. The majority of these studies have utilized fresh brain tumor specimens to isolate single cells using flow cytometry or antibody-based separation methods. Moving forward, the use of fresh-frozen tissue samples from biobanks will provide greater flexibility to single cell applications. Furthermore, as the single-cell field advances, the next challenge will be to generate multi-omics data from either a single cell or the same sample preparation to better unravel tumor complexity. Therefore, simple and flexible protocols that allow data generation for various methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and single nucleus Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) will be important for the field.
Recent advances in the single cell field coupled with accessible microfluidic instruments such as the 10x genomics platform have facilitated single cell applications in research laboratories. To study brain tumor heterogeneity, we developed an enhanced protocol for the isolation of single nuclei from fresh frozen gliomas. This protocol merges existing single cell protocols and combines a homogenization step followed by filtration and buffer mediated gradient centrifugation. The resulting samples are pure single nuclei suspensions that can be used to generate single nucleus gene expression and chromatin accessibility data from the same nuclei preparation.

Intra-tumoral heterogeneity is an inherent feature of tumors, including gliomas. We developed a simple and efficient protocol that utilizes a combination of buffers and gradient centrifugation to isolate single nuclei from fresh frozen glioma tissues for single nucleus RNA and ATAC sequencing studies.

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

Kanser Araştırmaları

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Katı Tümör Örneğinde Multiom Dizileme için Çekirdek İzolasyonu

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data, represents a breakthrough in our ability to discern tumor cell heterogeneity-a primary focus of translational cancer research at this time. However, the quality of sequencing data acquired using this advanced modality is highly dependent on the quality of the input material. 
Digestion conditions need to be optimized to maximize cell yield without sacrificing quality. This is particularly challenging in the context of solid tumors with dense desmoplastic matrices that must be gently broken down for cell release. Freshly isolated cells from solid tumor tissue are more fragile than those isolated from cell lines. Additionally, as the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be selected to support the total cell population. 
Finally, nuclear isolation conditions must be optimized based on these qualities in terms of lysis times and reagent types/ratios. In this article, we describe our experience with nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor specimens. We provide recommendations for tissue digestion, storage of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation and assessment.

Yazar Gündemi: Zorlu Tümör Mikro Ortamlarında Çoklu Dizileme için Çekirdek İzolasyonunun Geliştirilmesi

The protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform, including recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single-cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Nörobilim

<meta charset="utf8"></head><body>Bağırsak Manipülasyonu Yoluyla Postoperatif İleusun İncelenmesi için Murin Modeli

Postoperative Ileus Murine Model

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI is a consequence of mechanical damage during surgery, resulting in disruption of motility in the gastrointestinal tract. The mechanisms of POI are related to aberrant neuronal sensitivity, impaired epithelial barrier function, and increased local inflammation. However, the details remain enigmatic. Therefore, experimental murine models are crucial for elucidating the pathophysiology and mechanism of POI injury and for the development of novel therapies.
Here, we introduce a murine model of POI generated via intestinal manipulation (IM) that is similar to clinical surgery; this is achieved by mechanical damage to the small intestine by massaging the abdomen 1-3 times with a cotton swab. IM delayed gastrointestinal transit 24 h after surgery, as assessed by FITC-dextran gavage and fluorescence detection of the segmental digestive tract. Moreover, tissue swelling of the submucosa and immune cell infiltration were investigated by hematoxylin and eosin staining and flow cytometry. Proper pressure of the IM and a hyperemic effect on the intestine are critical for the procedure. This murine model of POI can be utilized to study the mechanisms of intestinal damage and recovery after abdominal surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Ameliyat Sonrası İleus Murin Modeli

We describe a murine model of postoperative ileus generated via intestinal manipulation. Gastrointestinal transit function, pathologic changes, and immune cell activation were assessed 24 h after surgery.

Ameliyat Sonrası İleus Murin Modeli

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

Taze ve donmuş Gastrointestinal örnekleri üzerinden hücre altı ayırma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan Frozen Gastrointestinal örneklerden CD 90+ fibroblast / miyofibroblastlar İzolasyonu

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

Ameliyat Sonrası İleus Murin Modeli