Konvansiyonel RT-PCR'ler, çakışan genler tarafından kodlanmış RNA'ları tespit etmek için kullanıldığında duyu ve anti-duyu dizileri arasında ayrımcılığa izin vermez. Bu protokol, özellikle anti-sense RNA'ları algılamayı mümkün kılar. Yüksek RNA denatürasyon sıcaklıkları ile birlikte biyotimlansae astar kullanımı anti-duyu cDNA amplifikasyon sağlar, non-spesifik RT ürünlerinin oluşumunu engelleyen.
Bu yöntemi, ASP'nin ya Bir RNA anti-duyusu ya da protein öncüsü olarak, yeni bir HIV antijeni olduğunu, tedavi için potansiyel olarak yeni bir HIV hedefi olduğunu göstermek için kullandık. Bu yöntem, çakışan genlerden anti-duyu RNA'ları tespit edilebilen herhangi bir sisteme uygulanabilir. PanASP astarları dahili pro-viral DNA dizisi kullanarak hastaya özel astarlar tasarlayarak başlayın.
Daha sonra, RNA'yı ölçün ve dna kontaminasyonunu DNase ile tedavi ederek ortadan kaldırın. 0.1 ile bir mikrogram toplam RNA'yı 96 iyi pcr plakalı uygun kuyulara aktarın. Sonra el yazması yönlere göre ters transkripsiyon veya RT reaksiyonu ayarlayın.
ASP ters astar yerine beş mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek endojen RT kontrollerini hazırlayın. Plakayı termocycler'a yerleştirin ve RNA'yı 5 dakika boyunca 94 dereceye ısıtın. Sonra hemen en az bir dakika buzlu suda soğutun.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi 1,5 mililitrelik bir tüpte reaksiyon karışımını hazırlayın, ardından 17,5 mikrolitreyi kuyu içeren RNA'nın her birine aktarın. RNA denatürasyonu 94 santigrat derecede yapılmalıdır. Toplam denatürasyon olmadan, duyu RNA non-spesifik ürünlerin sentezleri oluşabilir, non-spesifik cDA amplifikasyon yol.
Kuyuların içeriğini hafifçe karıştırın ve plakayı 55 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 15 dakika boyunca 70 santigrat dereceye plaka ısıtarak reaksiyonları inaktive. Bir litre 2X yıkama ve ciltleme tamponu el yazması talimatlara göre hazırlayın ve çözümü filtreleyin.
Ardından, PCR sınıfı su kullanarak 50 mililitre 1X yıkama ve bağlama tamponu hazırlayın. Streptavidin konjuge manyetik boncukların uygun sayıda 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra 2X yıkama ve bağlama tampon eşit hacim ekleyerek onları yıkayın ve 15 saniye boyunca tüp girdap. Tüpü manyetik ayırma rafına yerleştirin ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, dikkatle boncuk rahatsız etmeden supernatant çıkarın ve boncuk ların ilk hacmi olarak 2X yıkama ve bağlayıcı tampon aynı hacmi ekleyin. 30 saniye boyunca boncukvor ve 10 mikrolitre süspansiyon 1.5 mililitre tüpler uygun sayıda aktarın. Tüpleri manyetik ayırma rafına yerleştirin ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra, supernatant atın ve 2X yıkama ve bağlama tampon 50 mikrolitre ekleyin. Boncuklar ile ilgili tüplere biyotim 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça dönerken 30 dakika kuluçka. Kuluçkadan sonra tüpleri manyetik ayırma rafına üç dakika yerleştirin ve boncukları 200 mikrolitre 1X yıkama ve bağlama tamponuyla yıkayın ve ardından ayırma rafında üç dakikalık bir kuluçka alanı edin.
Supernatant atın ve iki kez yıkama tekrarlayın. Daha sonra, PCR sınıf su 10 mikrolitre boncuk resuspend. El yazması talimatlara göre uygun bir PCR Master Mix hacmi hazırlayın.
İyice karıştırın ve hızlı bir şekilde aşağı spin, sonra iyi başına 49 mikrolitre aktarın 96 iyi PCR plaka. 15 saniye boyunca saflaştırılmış cDNA ile tüpleri dikkatlice girdap ve ilgili kuyulara süspansiyon bir mikrolitre ekleyin. PCR çalıştırın ve% 1 agarose jel ürünleri ayırın.
Jel bantları kesin ve bir PCR 2.1 plazmid içine amplifiye ürünleri klonlamak. Sonra klonları sıralayın ve her diziyi analiz edin. İlk RT reaksiyonları düzenli non-biotynylated anti-sense primer ile yapıldı ve ASP başarılı amplifikasyon ile sonuçlandı.
Ancak, aynı molekül ağırlığı ve astar eksi kontrolleri bir bant da güçlendirilmiştir. Bu sorunu atlamak için, spesifik anti-sense astar biotyn ile etiketlendi ve ortaya çıkan anti-sense cDNA PCR önce saflaştırılmış. Bu, ASP dizisini astar eksi kontrollerde spesifik olmayan cDNA'dan büyük ölçüde azaltılmış kontaminasyonla güçlendirmeyi mümkün kıldı.
Bu yöntemin daha fazla optimizasyonu RT'den önce RNA'nın 94 santigrat derecede tam olarak denatürasyonu ile sağlandı ve ardından buzlu suda hemen soğutuldu ve asp bandının etkili bir şekilde amplifikasyonu sağlandı ve spesifik olmayan ürünler yok. ASP RNA'nın kinetikleri ölçüldü ve CD4 hücreleri saptanabilir viremi olan üç HIV pozitif denekten izole edildi ve anti-CD3/CD28 ile uyarılma sonrasında tedavi yokluğu yapıldı. ART uygulanan hastalarda, saptanamayan viremi olan hastalarda ASP RNA'nın sayısallaştırılması da mümkündür.
Her üç hastadan ikisinde asp RNA stimülasyonu ndan sonra 3-5 gün düşük seviyelerde saptandı. Asp ve env RNA'lar için iki hasta incelendi, biri tedavi edilmedi, biri tedavi edildi. Tedavi edilmeyen hasta için her iki RNA da tespit edilebilir.
Tedavi edilen hasta için, ASP ve env ancak stimülasyon birkaç gün sonra tespit edildi. Bu yordamı denerken, denatürasyonun RNA'yı doğrusallaştırdığını ve böylece RT'ye ulabilen ikincil yapıların yok edildiğini unutmamak gerekir. Oysa, boncuk yıkama olmayan biyotynylated cDNA'lar sifon.
CDNA'ların doğru polarite ile arındırılmasından sonra gen ekspresyonunu analiz etmek için qPCR yapılabilir. Ayrıca, CDNA'lar klonlanabilir ve dizi analizi için kullanılabilir. Bu yöntem, zıt yönde örtüşen genlerin incelenmesine olanak sağlar ve bir bakterinin ve bazı kanser türleri de dahil olmak üzere virüse bağlı hastalıkların düzenlenmesi ve patogenezi nin aydınlatılmasında yararlı olabilir.
