Bu yöntem, sadece floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel reaktif oksijen türlerini analiz etmek ve floresan levha okuyucu ile reaktif oksijen türlerinin yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir. DMEM'deki beşinci HCT116 kolorektal kanser hücrelerini 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya iki kez 10 ila 5 kat tohumlayarak başlayın.
Hücreleri bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 100 mikromolar demir sülfat veya 10 mikromolar doksorubisin içeren orta ile kültür ortamı değiştirin ve başka bir 24 saat boyunca plaka kuluçka. 10 milimolar stok çözümü yapmak için bir mililitre DMSO'da 4,85 miligram DCFH-DA eriterek DCFH-DA çözeltisini hazırlayın.
Kuyulara eklemeden hemen önce, 10 mikromolar çalışma çözeltisi yapmak için önceden ısıtılmış DMEM ile stok seyreltin ve 10 saniye girdap. Hücreleri lekelemek için, ilaç içeren ortamı çıkarın ve dmem ile bir kez yıkayın. Her kuyuya 500 mikrolitre DCFH-DA çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, DCFH-DA'yı kuyulardan çıkarın ve iki kez DMEM ile ve bir kez de PBS ile yıkayın. Daha sonra, her kuyuya 500 mikrolitre PBS ekleyin. Hücrelerin temsili görüntülerini çekmek için floresan mikroskoptaki yeşil floresan protein kanalını kullanın.
Sonra PBS çıkarın ve her kuyuya radyoimmünopremit analiz tampon200 mikrolitre ekleyin. Plakayı beş dakika buzüzerinde kuluçkaya yatırın ve hücre lisatlarını 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Tüpleri 21, 130 kez G'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Sonra 100 mikrolitre süpernatantı siyah 96 kuyuluk bir plakaya aktarın. Her kuyudaki floresansı ölçmek için 485 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda ve 530 nanometre lik bir emisyon dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu kullanın. Daha sonra, 100 mikrolitre protein istiyatçözeltisi çözeltisi ile süpernatantın bir mikrolitresini 96 kuyulu bir plakaya aktararak Bradford tsay ile protein konsantrasyonu ölçün.
Floresan yoğunlukları normalleştirmek için protein konsantrasyonları kullanın. HCT116 kolorektal kanser hücreleri oksidatif strese neden olmak için 100 mikromolar demir sülfat veya 10 mikromolar doksorubisin ile tedavi edildi. Beklendiği gibi, yeşil floresan önemli ölçüde her iki tedavi ile artmıştır.
Göreceli yoğunluk değişimlerini ölçmek için hücreler protein konsantrasyonları ile normalleştirildi. Göreceli floresan yoğunluğu demir sülfat veya doksorubisin ile önemli ölçüde artmıştır. Bu yordamı gerçekleştirirken, DCFH-DA çözümünü taze yapmak ve ışığa maruz kalmaktan kaçınmak, hücre durumu bozukluğunü en aza indirmek ve görüntü almadan hemen önce kapsamlı PBS yıkama yapmak önemlidir.
Bu protokol ile toplam ROS tespitine ek olarak, özellikle peroksit gibi ROS yapılabilir.
