Diese Methode kann verwendet werden, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies in anhaftenden Zellen mit nur einem Fluoreszenzmikroskop zu analysieren und die Intensität reaktiver Sauerstoffspezies mit fluoreszenzplattenleser zu quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig. Beginnen Sie mit der Aussaat von zwei mal 10 bis zu den fünften HCT116 Dickdarmkrebszellen in DMEM in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Kulturmedium durch 100 mikromolares Eisensulfat oder 10 mikromolare Doxorubicin-haltiges Medium, und bebrüten die Platte für weitere 24 Stunden. Bereiten Sie die DCFH-DA-Lösung vor, indem Sie 4,85 Milligramm DCFH-DA in einem Milliliter DMSO auflösen, um eine 10 Millimolar-Lagerlösung herzustellen.
Unmittelbar vor dem Hinzufügen in die Brunnen, verdünnen Sie den Bestand mit vorgewärmtDM, um eine 10 Mikromolar Arbeitslösung zu machen, und wirbeln Sie es für 10 Sekunden. Um die Zellen zu färben, entfernen Sie das medikamentenhaltige Medium und waschen Sie es einmal mit DMEM. Fügen Sie 500 Mikroliter DCFH-DA Arbeitslösung in jeden Brunnen, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.
Nach der Inkubation die DCFH-DA aus den Brunnen entfernen und zweimal mit DMEM und einmal mit PBS waschen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzu. Verwenden Sie den grünen fluoreszierenden Proteinkanal am Fluoreszenzmikroskop, um repräsentative Bilder der Zellen zu machen.
Entfernen Sie dann die PBS, und fügen Sie 200 Mikroliter Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte fünf Minuten lang auf Eis bebrüten und die Zelle lysiert in 1,5 Milliliter-Röhren sammeln. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 21, 130 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann 100 Mikroliter des Überstandes auf eine schwarze 96-Well-Platte übertragen. Verwenden Sie einen Mikroplattenleser mit einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 530 Nanometern, um die Fluoreszenz in jedem Brunnen zu messen. Als nächstes messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay, indem Sie einen Mikroliter des Überstandes auf eine klare 96-Well-Platte mit 100 Mikroliter Protein-Assay-Lösung übertragen.
Verwenden Sie die Proteinkonzentrationen, um die Fluoreszenzintensitäten zu normalisieren. HCT116 Dickdarmkrebszellen wurden mit 100 mikromolarem Eisensulfat oder 10 mikromolarem Doxorubicin behandelt, um oxidativen Stress zu induzieren. Wie erwartet, wurde die grüne Fluoreszenz durch beide Behandlungen dramatisch erhöht.
Um die relativen Intensitätsänderungen zu quantifizieren, wurden die Zellen lysiert und mit Proteinkonzentrationen normalisiert. Die relative Fluoreszenzintensität wurde durch Eisensulfat oder Doxorubicin signifikant erhöht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die DCFH-DA-Lösung frisch zu machen und Lichteinwirkung zu vermeiden, sowie Zellstatusstörungen zu minimieren und eine umfangreiche PBS-Wäsche direkt vor der Aufnahme durchzuführen.
Neben der Detektion des gesamten ROS durch dieses Protokoll können insbesondere ROS wie Peroxid durchgeführt werden.
