この方法は、接着細胞の細胞活性酸素種を蛍光顕微鏡だけで分析し、蛍光プレートリーダーで反応酸素種の強度を定量するために使用できます。このプロトコルは、シンプルで効率的で、費用対効果が高いプロトコルです。DMEMのHCT116大腸癌細胞を24ウェルプレートの各ウェルに2回10回播種することから始めます。
細胞を摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、培養培地を100ミクロモル硫酸第一鉄、または10マイクロモルドキソルビシン含有培地に交換し、さらに24時間プレートをインキュベートする。DCFH-DAの4.85ミリグラムをDMSOの1ミリリットルに溶解して、10ミリモルのストック溶液を作り出して、DCFH-DA溶液を調製します。
井戸に加える直前に、あらかじめ温めたDMEMでストックを希釈して10マイクロモル加工溶液を作り、10秒間渦を出します。細胞を染色するには、薬物含有培地を取り出し、DMEMで一度洗います。各井戸に500マイクロリットルのDCFH-DA作業溶液を加え、30分間摂氏37度でプレートをインキュベートします。
インキュベーション後、DCFH-DAをウェルから取り出し、DMEMで2回、PBSで1回洗浄します。次に、各ウェルに500マイクロリットルのPBSを加えます。蛍光顕微鏡の緑色蛍光タンパク質チャネルを使用して、細胞の代表的な画像を撮影します。
次いでPBSを取り出し、各ウェルに200マイクロリットルの放射性免疫沈降アッセイバッファーを加える。氷の上にプレートを5分間インキュベートし、細胞ライセートを1.5ミリリットルのチューブに集めます。チューブを摂氏4度で10分間10分間21、130倍Gで遠心分離する。
その後、上清の100マイクロリットルを黒い96ウェルプレートに移します。マイクロプレートリーダーは、励起波長485ナノメートル、発光波長530ナノメートルで、各ウェルの蛍光を測定します。次に、1マイクロリットルの上清を100マイクロリットルのタンパク質アッセイ溶液を用いた透明な96ウェルプレートに移すことによって、ブラッドフォードアッセイでタンパク質濃度を測定します。
タンパク質濃度を使用して蛍光強度を正規化します。HCT116大腸癌細胞を100ミクロモル硫酸第一鉄、または10ミクロモルドキソルビシンで処理し、酸化ストレスを誘発した。予想通り、両方の治療によって緑色蛍光が劇的に増加した。
相対的な強度変化を定量化するために、細胞をタンパク質濃度でリズし、正規化した。この相対蛍光強度は、硫酸第一鉄またはドキソルビシンによって有意に増加した。この手順を実行する際には、DCFH-DA溶液を新鮮にし、光暴露を避け、細胞状態障害を最小限に抑え、画像を撮る直前に広範なPBS洗浄を行うことが重要です。
このプロトコルによる総ROSの検出に加えて、具体的には過酸化物などのROSを行うことができる。
