Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate

Questo metodo può essere utilizzato per analizzare le specie di ossigeno reattivo cellulare nelle cellule aderenti con solo un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità reattiva delle specie di ossigeno con il lettore di piastre a fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente ed economico. Inizia seminando due volte 10 alla quinta cellule tumorali colorettali HCT116 in DMEM in ogni pozzo di una piastra da 24 porri.

Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il mezzo di coltura con 100 solfato ferroso micromolare, o 10 mezzo contenente doxorubicina micromolare, e incubare la piastra per altre 24 ore. Preparare la soluzione DCFH-DA sciogliendo 4,85 milligrammi di DCFH-DA in un millilitro di DMSO per fare una soluzione di 10 millimolare.

Poco prima di aggiungerlo ai pozzi, diluire il materiale con DMEM preri riscaldato per creare una soluzione di lavoro da 10 micromolari e vortice per 10 secondi. Per macchiare le cellule, rimuovere il mezzo contenente farmaci e lavarle una volta con DMEM. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavoro DCFH-DA in ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, rimuovere il DCFH-DA dai pozzi e lavarli due volte con DMEM e una volta con PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri di PBS ad ogni pozzo. Utilizzare il canale proteico fluorescente verde sul microscopio a fluorescenza per scattare immagini rappresentative delle cellule.

Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione a ciascun pozzo. Incubare la piastra sul ghiaccio per cinque minuti e raccogliere i liscivi cellulari in tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi a 21, 130 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi trasferire 100 microlitri del supernatante su una piastra nera da 96 porri. Usa un lettore di micropiastrite ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nanometri, per misurare la fluorescenza in ogni pozzo. Successivamente, misurare la concentrazione proteica con il saggio di Bradford trasferendo un microlitro del supernatante in una piastra chiara da 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione di dosaggio proteico.

Utilizzare le concentrazioni proteiche per normalizzare le intensità di fluorescenza. Le cellule tumorali colorettali HCT116 sono state trattate con 100 solfati ferrosi micromolari, o 10 doxorubicina micromolare, per indurre stress ossidativo. Come previsto, la fluorescenza verde è stata drasticamente aumentata da entrambi i trattamenti.

Per quantificare i cambiamenti di intensità relativa, le cellule sono state lese e normalizzate con concentrazioni proteiche. L'intensità relativa della fluorescenza è stata significativamente aumentata dal solfato ferroso o dalla doxorubicina. Quando si esegue questa procedura, è importante rendere fresca la soluzione DCFH-DA ed evitare l'esposizione alla luce, nonché ridurre al minimo i disturbi dello stato delle cellule ed eseguire un ampio lavaggio PBS subito prima di scattare l'immagine.

Oltre al rilevamento del ROS totale da parte di questo protocollo, è possibile eseguire specificamente ROS come il perossido.