이 방법은 형광 현미경만으로 부착 된 세포에서 세포 반응성 산소 종을 분석하고 형광 판 판독기와 반응성 산소 종 강도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다. DMEM의 제5 HCT116 대장암세포를 24웰 플레이트의 각 웰로 2회 10번 시드하는 것으로 시작한다.
섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, 배양 배지를 100 마이크로몰라 철황산염 또는 10마이크로몰러 독소-비카인 함유 매체로 대체하고, 플레이트를 24시간 동안 배양한다. DMSO의 1밀리리터에 4.85 밀리그램의 DCFH-DA를 용해하여 DCFH-DA 솔루션을 준비하여 10 밀리몰러 스톡 솔루션을 만듭니다.
우물에 추가하기 직전에 미리 데워진 DMEM으로 주식을 희석하여 10 마이크로몰러 작동 솔루션을 만들고 10 초 동안 소용돌이를 만듭니다. 세포를 염색하려면 약물 함유 매체를 제거하고 DMEM으로 한 번 세척하십시오. DCFH-DA 작업 용액 500마이크로리터를 각 웰에 추가하고 30분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
인큐베이션 후, 우물에서 DCFH-DA를 제거하고 DMEM으로 두 번, PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 500 마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 형광 현미경에 녹색 형광 단백질 채널을 사용하여 세포의 대표적인 이미지를 취하십시오.
그런 다음 PBS를 제거하고 200 마이크로리터의 방사성 면역 침전 분석 분석 버퍼를 각 우물에 추가합니다. 5 분 동안 얼음에 접시를 배양하고, 1.5 밀리리터 튜브로 세포 용액을 수집합니다. 4°C에서 10분 동안 21, 130회 G에서 튜브를 원심분리합니다.
그런 다음 상체의 100 마이크로리터를 검은 색 96 웰 플레이트로 옮기습니다. 485 나노미터의 내분 파장에서 마이크로 플레이트 판독기를 사용하고 530 나노미터의 방출 파장을 사용하여 각 우물의 형광을 측정합니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 단백질 분석 용액을 가진 투명 96웰 플레이트에 상체의 마이크로리터 1개를 전송하여 브래드포드 분석으로 단백질 농도를 측정합니다.
단백질 농도를 사용하여 형광 강도를 정상화하십시오. HCT116 대장암세포는 산화 스트레스를 유도하기 위해 100개의 미세몰라 철황산염 또는 10개의 미세몰어 독소비신으로 치료되었다. 예상대로, 녹색 형광은 극적으로 두 치료에 의해 증가했다.
상대강도 변화를 정량화하기 위해 세포는 단백질 농도로 lysed 및 정규화되었다. 상대형형광강도는 철황산염 또는 독소루비신에 의해 현저히 증가되었다. 이 절차를 수행할 때DCFH-DA 솔루션을 신선하게 만들고 광 노출을 방지하고 세포 상태 장애를 최소화하고 이미지를 촬영하기 직전에 광범위한 PBS 세척을 수행하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜에 의한 총 ROS검출 외에도, 특히 과산화수소와 같은 ROS를 수행할 수 있다.
