Bu protokol, hedeflenen gen iletiminin B-1a hücre lokalizasyonunu ve işlevini nasıl etkilediğini değerlendirebilir ve in vivo gen terapötik potansiyellerini incelemek için kavram yaklaşımının yararlı bir kanıtı olabilir. Bu yöntem primer B-1a hücrelerine istikrarlı ve nispeten verimli gen iletimi sağlar ve donör hücre fenotip ve fonksiyon post-adoptive transferi belirlenmesini sağlar. Bu yöntem, hücre sağkalım, çoğalma ve fonksiyon da dahil olmak üzere vivo çeşitli donör ve konak hücre süreçlerini incelemek için kullanılabilir ve diğer benimseyen transfer sistemlerine uygulanabilir.
Periton sıvısı hasat zor olabilir. Iyice kurtarma maksimize etmek ve periton hücre popülasyonunu kontamine edebilir bağırsakdelinmek önlemek için hücreleri devre dışı emin olun. Periton B-1 hücre koleksiyonu için, 12-14 haftalık, erkek, CD45.1+apolipoprotein E nakavt farenin karnında yüzeysel bir kesik yapmak için düz cerrahi makas kullanın ve periton duvarını ortaya çıkarmak için cildi soymak için kavisli makas kullanın.
25 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik şırınga kullanarak, 37 derece RPMI-1640 orta 10 mililitre ile periton boşluğu floş. Farenin 15 ila 20 saniye boyunca bir taraftan diğer tarafa iyice sarsılabilmesi için kuyruğun tabanını kavrayın. Sallayarak sonra, hip seviyesinin hemen üzerinde periton sağ alt tarafında sıvı aspire şırınga kullanın, bağırsakyakınında, epidydimal yağ depoları ve altta yatan organları bozmamak için dikkat.
Lavaj altı ila yedi mililitre topladıktan sonra, buz üzerinde 50 mililitre konik tüp içine sıvı dağıtmak. Kalan sıvının periton boşluğunun dibinde kalması için hayvanın dikey yükselmesine izin vermek için diyaframın üzerindeki periton duvarını kavramak için periton kullanın. Karaciğer kendisi kesmeden karaciğer üzerinde periton duvarında küçük bir kesim yapmak için cerrahi makas kullanın.
Ve kalan periton sıvısı toplamak için bir cam pipet ve ampul kullanın. Tüm sıvı toplandığında, tüm farelerin periton yıkama hücreleri aliquot ve buz üzerinde 50 mililitre tüpler tüp konsantrasyonu başına sekizinci hücrelere bir kez 10 kadar ekleyin. Ve hücreleri santrifüjle tortular.
Dört derece santigrat bir 10 dakikalık kuluçka için bir ila 50 oranında ürelmiş anti-CD16/CD32 antikor bir mililitre her pelet resuspend. Kuluçka sonunda, her tüpe eşit hacimli biyotinylated antikor ana karışımı ekleyin ve ardından tüp başına beş mililitre lik bir arabellek tesbit edin. Anti-biotin mikroboncukların uygun hacmi ve hücre konsantrasyonu ve üreticinin tavsiyesi ve tüp başına beş mililitrelik bir tetkik tampon yıkama ardından başına uygun kuluçka süresi ile peletre resuspend.
Her peleti 500 mikrolitre lik bir azar arabelleği içinde yeniden askıya alın ve sütun başına üç mililitre lik bir arabellek içeren uygun sayıda manyetik seçim sütunu asal. Hücreleri, buz üzerinde 15 mililitrelik konik bir tüpte zenginleştirilmiş B-1 hücreleri içeren elüent toplayan astarlı kolonlar üzerine aktarın. Daha sonra, toplanan toplam hacim 10 mililitre olana kadar her manyetik seçim sütunu ek bir deneme arabelleğiyle yıkayın ve arınmış hücre fraksiyonu bir defada 10 ila B hücre kültürü ortamındaki mililitre konsantrasyonu başına altıncı hücreyi yeniden askıya alın.
Geçirel B-1 hücrelerini uyarmak için en az bir kez 10'u yedinci hücrelere ayırıp transdüksiyon için kalan hücreleri iki eşit hacime bölün. Hücreleri 150 mikrolitre orta konsantrasyonda beşinci hücrelere 1,5 kat 10'a seyreltin ve transdüksiyon durumu için 96 kuyulu yuvarlak alt plakanın kuyularına 150 mikrolitre hücre ekleyin. Daha sonra her kuyuya 100 nanomolar TLR9 agonist ekleyin ve 16 ila 18 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesinde plakaları yerleştirin.
Periton B hücrelerinin retroviral transdüksiyonu için kalsiyum fosfat transfeksiyon retroviral partikül stokları buz üzerinde çözülür ve hemen kontrol ve kemokin reseptör retroviral supernatants her kuyuya uygun plaka ve enfeksiyon çokluğu ekleyin 20'ye bir polibren mililitre başına 8 mikrogram ve taze beta-mercaptoethanol varlığında 55 mikromolar son konsantrasyon. Tüm virüsler eklendiğinde, santrifüj ile hücreleri spinfect ve üç saat boyunca hücre kültürü kuluçka plakaları yerleştirin. Kuluçka sonunda, taze B hücre li orta ve bir gecede kuluçka replating için hücreleri hasat.
Diğer periton hücre tiplerinin manyetik tükenmesi sonrasında, tükenme sonrası fraksiyondaki canlı singlet hücreleri F4/80+makrofajlara göre DAHA BÜYÜK oranda CD19+B hücrelerine ve CD5hi CD19-T hücrelerinin eksikliğine sahiptir ve ön tükenme fraksiyonuna göre CD19+CD5 orta B-1a hücrelerinin artan frekansını içerirler. Ve başarılı bir şekilde transize GFP +B-2, B-1, B-1a ve B-1b hücre alt kümelerinin sıklığındaki artış, virüsün enfeksiyon çokluğundaki artışla doğrudan ilişkilidir. Ve transdüksiyon verimliliği daha da 24-iyi veya 6-iyi plakalar kullanımına göre 96 iyi yuvarlak alt plakalar kullanılarak artırılabilir.
CXCR4-GFP retrovirüs transdüksiyonu başarılı bir B-1 hücreli CXCR4 aşırı ekspresyonuna neden olabilir ve B hücresi canlılığı üzerinde önemli bir etkisi olmadan CXCL12 doğru in vitro göç artışı. Buna ek olarak, cd45.1+donör hücreleri kemik iliği ve CD45.2 alıcı farelerin dalaklarından 17 hafta hücre transferi sonrası iyileştikten sonra CXCR4 aşırı ekspresyonunu sürdürmektedirler. CXCR4 ekspresyonu ile donör hücre lokalizasyonu ile kemik iliği arasında pozitif bir ilişki saptandı ama dalak saptanmama.
Kemik iliğindeki donör hücre sayıları ile anti-MDA-düşük yoğunluklu lipoprotein IgM plazma miktarı arasında pozitif bir ilişki gözlenmiştir. Hedeflenen gen doğumunun hastalık gelişimi üzerindeki etkisi veya salgılanan faktörlerin konak fizyolojisini etkilediği gibi soruları yanıtlamak için birçok ek teknik kullanılabilir.
