우리는 PVX-LIC 벡터를 제공한 칭화 대학의 율류 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 텍사스 A&M 농업 연구및 미국 농무부(USDA) 국립 식품 농업 연구소에서 JS에 이르기까지 해치 프로젝트 TEX0-1-9675의 스타트업 펀드에 의해 지원되었습니다.

1. 감자 식물을 성장.
<ol><li>무라시게와 스쿠그(MS) 미디어와 감보르그 비타민(MS 기저염 혼합물, 감보리의 비타민, 30g/L 수당, 3.5g/L agar, pH = 5.7)을 함유한 배양 튜브(25 x 150mm)에 체외 감자 식물을 전파합니다. 20-22°C, 16h 라이트/8h 다크 포토기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 성장실에 튜브를 놓습니다. 참고 : 새로운 싹과 뿌리는 일반적으로 식물에서 1-2 주에 개발됩니다. 매달 신선한 MS/감보르그의 비타민 미디어를 통해 식물을 전파합니다.</li>
	<li>4주 후, 체외 식물을 토양으로 이식하고 20-22°C, 16h 빛/8h 어두운 광기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 온실에서 자랍니다. 참고: 새로 발달된 뿌리와 잎이 있는 식물은 이식에 적합합니다. 처음 3-4 일 동안 갓 이식 된 식물에 대한 수분을 유지합니다.</li>
</ol>2. VbMS 벡터를 구성합니다.
<ol><li>짧은 탠덤 TM 분자(STTM, 도 1)22,53을 설계 및 복제하여 관심 있는 miRNA에 대해. 참고: 실험 데이터 또는 miRbase 데이터베이스54,55,56,57,58,59를 기반으로 miRNA 서열을 획득합니다. 이 연구에서 사용되는 miR166 서열은 이전에 설명되었다60.<ol>
<li>TM 모듈을 miRNA의 10-11뉴클레오티드에 대응하는 부위에 miRNA의 역형 체열에 일반적으로 5'-CTA-3'을 삽입하여 TM 모듈을 설계한다. 참고: 예를 들어, Stu-miR160 서열은 5'-UGUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61이며, 여기서 10-11번째 뉴클레오티드가 굵게 있다. 역보체 서열(탈옥뉴클레오티드)은 5'-GGCATACAGAGCCAGCA-3'이며 불일치 벌지 삽입 부위는 굵게 표시됩니다. TM 분자 서열(탈옥핵증)은 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'이어야 한다.</li>
		<li>STTM 조각을 복제하기 위한 리머를 디자인합니다(그림 1). 48nt 스페이서 서열과 함께 DNA 올리고뉴클레오티드를 PCR 복제를 위한 템플릿으로 사용하십시오. 포워드 프라이머는 LIC1 링커(5'-CgACgACAAGACCgT-3'), TM 분자용으로 설계된 위의 전방 서열, 48nt 스페이서(5'-GTTGTTGTTTATGGT-3')의 부분 5' 서열로 구성된다. 역프라이머는 LIC2 링커(5'gAgAgAgCCgT-3'), TM 분자의 역형 보체 서열, 48nt 스페이서(5'-ATTCTTCTTTTAGACCAT-3')의 3'시퀀스에 대한 부분역 보체로 구성된다. 참고: 48nt 스페이서 시퀀스는 5'-GTTGTTGTTATTTCTAATTCTAATTCTAATTCTAAA아가AT-3'입니다. 예를 들어, STTM-miR160의 경우, 포워드 프라이머는 5'-CgACgACAAGACCgT-GGCATACAGGG-CTA-GAGCCAGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'이어야 한다. 역프라이머는 5'-gAgAgAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CTGTATGCC-ATTCTCTTCTTTAGACCAT-3'(그림 1)이어야 한다.</li>
		<li>합성된 범블 48nt 스페이서를 템플릿및 높은 충실도 DNA 폴리머라아제로서 합성된 범용 48nt 스페이서를 사용하여 PCR에 의해 50 μL의 부피로 STTM 단편을 증폭시한다.<ol>
<li>각 프라이머(40 μM), 48nt 스페이서 올리고(40 μM), 10x PCR 버퍼의 5μL, 5μL을 혼합하여 PCR 반응을 설정, dNTP 혼합물(각 10mM), 고충실도 DNA 폴리머라제(10U/μL)의 0.1 μL, ddH2O의 43μL은 총 50μL의 부피로 표준 PCR 증폭을 수행합니다. 94°C 3분, 94°C의 32사이클은 45s, 60°C는 45s, 72°C는 60초용.</li>
		</ol>
</li>
		<li>에탄올 강수량에 의해 STTM 조각을 정화합니다. PCR 제품에 2.5권의 에탄올과 1/10 부피를 3M 아세테이트(pH = 4.0)를 추가합니다. 14,000 x g 에서 10분 간 활발하게 원심분리기를 섞습니다. 상체를 제거하고 70 % 에탄올의 1 mL로 펠릿을 헹구십시오. 펠릿을 건조시키고 ddH2O의 20 μL로 녹입니다. 참고: DNA 전기전도를 사용하여 STTM PCR 제품의 증폭을 확인합니다.</li>
		<li>정제된 STTM PCR 제품의 2.5 μL, 10x T4 DNA 폴리머라제 버퍼의 0.5 μL을 혼합하여 얼음에 T4 DNA 폴리머라제 반응을 설정, 0.05 μL 의 1 M 디티오트리톨 (DTT), 0.25 μL 100 mM dATP, T4 DNA 폴리머라제의 0.1 μL (3 U/μL), 및 ddH2O의 1.6 μL은 총 부피 5 μL. 37 °C에서 혼합물을 37°C에서 배양합니다. T4 DNA 폴리머라아제의 비활성화를 위해 제품을 75°C에서 20분 동안 치료한다.</li>
	</ol></li>
	<li>PVX 기반 VbMS 구조를 준비합니다.<ol>
<li>100 μL의 부피에서 2.5 μL의 SmaI (20 U/μL)를 가진 PVX-LIC 플라스미드38의 5 μg를 소화합니다.</li>
		<li>페놀:클로로폼:이소프로파놀(25:24:1, pH = 6.7/8.0)을 소화된 PVX-LIC 제품에 동일한 볼륨을 추가하고 격렬하게 혼합합니다. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상체부를 새로운 원심분리기 튜브로 옮긴다. 동일한 부피의 클로로폼을 추가: isopropanol (24:1) 적극적으로 소용돌이. 10 분 동안 14,000 x g 에서 원심 분리기. 참고: PVX-LIC 벡터는 복제를 위해 LIC 카세트를 항구합니다. PVX-LIC 벡터의 LIC 카세트는 ccdB 유전자와 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하고 있으며, 가나마이신(50 μg/L) 및 클로람페니콜(15 μg/L)을 함유하는 LB 배지를 사용하여 대장균 DB3.1에서 유지/전파될 필요가 있다.</li>
		<li>새로운 원심분리기 튜브로 상체를 옮는다. 에탄올 2.5부와 아세테이트 1/10부(pH = 4.0)를 넣고 적극적으로 섞는다. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상복부를 제거합니다.</li>
		<li>펠릿을 70% 에탄올과 소용돌이의 1mL로 강하게 헹구세요. 14,000 x g 의 원심분리기는 10분 동안 상복부를 제거합니다. 펠릿을 건조시키고 소화된 PVX-LIC 플라스미드를 ddH2O 100 μL로 녹입니다.</li>
		<li>소화된 PVX-LIC 벡터 DNA의 2.5 μL을 혼합하여 얼음에 T4 DNA 폴리머라제 반응을 설정, 0.5 μL 의 10x T4 DNA 폴리머라제 버퍼, 0.05 μL 1 M DTT, 0.25 μL 100 mM dTTP, T4 DNA 폴리머라제 (3 U/μL)의 0.1 μL은 총 부피5 μL에서 혼합물을 37 °C에서 15 분 동안 37 °C로 배양하고 25 분에서 치료하는 데 20 분 T4 DNA 폴리머라아제비활성화.</li>
	</ol></li>
	<li>STTM 시퀀스를 LIC 반응을 사용하여 PVX-LIC 벡터로 복제합니다. T4 DNA 폴리머라제 처리 STTM PCR 제품(5 μL)과 T4 DNA 폴리머라제 처리 PVX-LIC 플라스미드(5 μL)를 혼합한다. 70°C에서 5분간 배양하고, 0.1°C/s의 경사로에서 22°C까지 식히고, PCR 기계를 사용하여 30분 동안 22°C로 보관하십시오. 참고: LIC 복제의 높은 효율을 달성하기 위해 잠복기 시간을 4°C에서 하룻밤로 연장합니다.</li>
	<li>LIC 반응 제품의 5 μL을 대장균 DH5α로 변환하고 50 μg/mL kanamycin62,63을 포함하는 LB 플레이트에서 성장한다. PVX-LIC 벡터에 대한 복제 프라이머및 범용 프라이머로 PCR에 의해 양수 콜로니를 선택하고 검증한 다음 시퀀싱합니다.<ol>
<li>양성 클론을 식별하기 위해 STTM 복제용 역 프라이머와 함께 PVX-LIC(5'GTTGGCTTGCAACTAGAT-3')의 포워드 프라이머로 콜로니 PCR을 수행합니다. PCR 대역의 크기는 ~300 bp여야 합니다. 참고: 종료기 주기 시퀀싱64,65에 의해 STTM 조각의 시퀀스를 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>검증된 클론으로부터 PVX-STTM 플라스미드를 분리하여 그로박테리움 균주 GV3101, GV2260 또는 EHA10562,63으로 변환합니다. PCR에 의해 아그로박테리움 식민지를 확인합니다. 참고: PVX-LIC의 전방 프라이머와 STTM 복제를 위한 역 프라이머를 사용하여 PCR에 의한 아그로박테리움 콜로니를 확인합니다.</li>
</ol>3. 감자 식물에서 PVX 기반 VbMS 분석 작업을 수행합니다.
<ol><li>체외 감자 식물을 토양으로 이식합니다. 이식된 식물은 3-4일 후에 VbMS 분석의 대상이 됩니다.</li>
	<li>PVX-STTM 플라스미드를 함유한 아그로박테리움 을 함유한 감자 식물을 접종한다. 참고: 감자의 VbMS 분석의 경우 , 아그로박테리움 매개 침투 및 이쑤시개 긁힘 접종이 동시에 수행됩니다.<ol>
<li>50 μg/mL 카나마이신 및 50 μg/mL 리팜피신을 포함하는 액체 LB의 50mL로 PVX-STTM 벡터를 포함하는 양성 변압제를 선택하고 접종합니다. OD600 = 1.0까지 16 시간 동안 220 rpm에서 28 °C 인큐베이터에서 성장합니다.</li>
		<li>동시에, 양성 아그로박테리움 콜로니를 50 μg/mL 카나마이신 과 50 μg/mL 리팜피신을 포함하는 적어도 2개의 새로운 LB 플레이트에 줄이며 1일 동안 28°C에서 자랍니다. PVX-LIC38,66 벡터를 대조군으로 포함시키고 PVX-GFP67,68을 모니터링하여 바이러스 확산을 모니터링한다.</li>
		<li>Agrobacterium 액체 배양을 원심분리로 3,400 x g에서 실온에서 10분 동안 수집합니다. 침투 완충제(10m MgCl2, 10mM MES 및 200 μM 아세토시링곤, pH = 5.6)의 동일한 부피로 아그로박테리움 세포를 재차 중단하고 OD600 = 1.0으로 조정한다. 6 시간 동안 실온에서 배양하십시오.</li>
		<li>1 mL 바늘없는 주사기로 완전히 확장 된 잎의 축축 측에 Agrobacterium 문화에 침투하십시오.<ol>
<li>한 손으로 잎을 뒤집어 들고 한 손가락을 사용하여 침투 부위의 adaxial 측에서 잎 라미나를 지원합니다. 주사기를 다른 손으로 잎 표면에 수직으로 유지하고 Agrobacterium 문화에 침투하여 라미나의 축축한 면으로 침투합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>LB 플레이트에서 Agrobacterium 배양을 긁어 내고 이쑤시개를 가진 침투 된 감자 식물의 첫 번째 하나 또는 두 개의 상호 노드의 줄기 표면을 긁습니다. 줄기의 표피를 부드럽게 긁습니다. 식물에 심각한 손상을 일으킬 수있는 줄기를 관통하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>16h 빛/8h 어두운 광기간과 온실에서 120 μmol/m2∙ s1 의 광강도로 22°C에서 침투된 식물을 성장시다. 참고: miRNA 침묵으로 인한 표현형은 일반적으로 2-4주 후 접종에 나타납니다(그림 2, 그림 3). VbMS 표현형이 침투 후 나타나는 데 는 일반적으로 10-20 일이 걸립니다. VbMS 표현형은 특정 miRNA 및 표적 유전자, 성장 조건 및 감자 품종의 특성에 달려 있습니다.</li>
</ol>4. 식 분석을 수행합니다.
<ol><li>표현형이 2-4주 후 접종에 나타나면 VbMS 식물의 현상형과 가위를 가진 대조군 식물의 피노타입이 있는 사격, 잎, 꽃 또는 뿌리와 같은 조직을 수집합니다. 수집된 조직에서 총 RNA를 분리합니다.</li>
	<li>전기전도62,63에 의한 RNA 품질을 확인하고 분광광계로 OD260 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 정량화한다.</li>
	<li>줄기 루프 실시간 역전사 PCR(RT-PCR)을 사용하여 miRNA 발현을 분석한다.<ol>
<li>특정 miRNAs의 경우 줄기 루프 역전사 프라이머를 디자인합니다. 줄기 루프 RT 프라이머는 보편적 인 5 '백본과 특정 miRNA의 3'6 nt 확장을 포함합니다. 줄기 루프 구조를 형성하는 5'- GTCTCTGGTGGGGAgggtgggtgtattcGCACCAGAGGAGAC-3')를 설계합니다. (대문자는 역반복 시퀀스와 루프 영역에 대한 소문자에 해당한다).</li>
		<li>루프를 형성하는 5' 백본 서열의 일부는 후속 PCR 증폭을 위한 역프라이머 역할을 한다(백본 서열에서 굵은 기울임꼴 시퀀스). 줄기 루프 프라이머에 관심 있는 miRNA의 3'말에 역보완적 인 6 nt 확장 서열을 추가하여 역전사에 대한 특이성을 제공합니다(보충 도 1A). 참고: 첸 외.69 및 에리카 바르코니-가스 외.70,71,72에 의해 설명된 바와 같이 줄기 루프 역 전사 프라이머를 설계한다. 예를 들어, 스튜-miR160용 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-GTCTCCTGTGGCagggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'로 설계되었습니다. 감자 miR165/166 제품군을 위한 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-GTCTCCTGTGGCagggtgtattcGCACCAGAGGAGACGGGGGG(A/G)A-3'로 설계되었습니다. (굵은 대문자 시퀀스는 특정 miRNA에 대한 역 전사의 특이성을 제공합니다).</li>
		<li>총 RNA의 50-200 ng를 혼합하여 역전사 반응을 설정, 줄기 루프 역전사 프라이머(100 μM), 10x 버퍼의 2μL, RNase 억제제의 0.2 μL(40 U/μL), dNTP의 0.25 μL(각 10mM), 그리고 얼음 에 대한 역전사 1μL(200 U/μL)의 1μL. 20 μL의 총 부피에 뉴클레아제 없는 ddH2O를 추가합니다.</li>
		<li>펄스 역 전사 절차를 사용하여 역전사를 수행합니다. 역전사 반응 혼합물을 16°C에서 30분 동안 배양하고, 30초동안 30°C, 30s용 42°C, 1초에 대해 50°C의 온도 주기를 수행하고, 총 60사이클동안, 5분 동안 85°C에서 배양하여 역전사를 비활성화한다.</li>
		<li>miRNA 발현의 실시간 PCR 분석을 위해 miRNA 서열을 기반으로 전방 프라이머를 설계하지만 위에서 설계된 줄기 루프 역전사 프라이머와 겹치는 서열을 포함하지 않는다. 길이, 용융 온도 및 GC 콘텐츠를 최적화하기 위해 전방 프라이머의 5'에 3-7nt 확장을 추가합니다(보충 도 1). 참고 : 보편적 인 역 프라이머는 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'입니다. 예를 들어, 스튜-miR160용 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'로 설계되었습니다. miR165/166 제품군을 위한 줄기 루프 역전사 프라이머는 5'-CGGCTCGGACCACCAGGCTT-3'입니다. 굵은 시퀀스는 프라이머 최적화를 위한 5' 확장 역할을 합니다. miRNA용 줄기 루프 역전사 프라이머 및 실시간 PCR 프라이머는 miRNA 프라이머 디자인 Tool73을 사용하여 설계할 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>표준 역전사 PCR(RT-PCR)에 의해 대상 mRNA의 cDNA를 합성합니다. 역전사 반응 혼합물을 37°C에서 60분 동안 배양하고 5분 동안 85°C로 가열하여 역전사를 비활성화한다. 참고: (1) 표적 mRNA가 알려지지 않은 경우 psRNATarget program74 를 사용하여 표적 mRNAs를 예측한다. (2) mRNA를 위한 보편적인 역전사 프라이머는 고정된 프라이머 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'이다.</li>
	<li>관심있는 miRNA와 대상 mRNAs 모두에 대한 실시간 PCR 반응을 설정합니다. 템플릿 cDNA의 0.5 μL, 2배 실시간 PCR 버퍼 5μL, 각 전방 및 역 프라이머(40 μM)의 0.05 μL, ddH2O의 4.4 μL을 얼음에 5μL의 총 부피로 혼합합니다.</li>
	<li>3 분 동안 95 °C에서 배양하고, 30 s용 95 °C의 40 사이클과 60 °C에서 30 초동안 배양하십시오. 다음과 같이 후속 용융 곡선 해석을 수행 : 15 초에 대한 95 °C에서 인큐베이션, 20 °C / s의 경사로에서 60 °C로 냉각, 60 s에 대한 60 °C에서 유지, 0.2 ° C /s의 경사로에서 95 °C에 가열, 15 s에 대한 95 °C에서 유지. ΔΔCt 메서드76,77을 사용하여 Ct 값을 분석하고 표준 오류로 수단을 플롯합니다. 참고: (1) 대상 mRNA용 실시간 PCR 프라이머는 설명된 것으로 설계될 수 있다75. (2) 감자 폴리비퀴틴 10 유전자는 감자의 정상화를 위한 내부 통제역할을 할 수 있다. 감자 폴리우비퀴틴 10 유전자의 포워드 프라이머는 5'-ATGTTGCCTTGTGTGTGTGTTTGTTG-3'과 역프라이머 5'-TTATTATTCACATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGTTCAACC-3'이다. (3) 실시간 PCR 분석의 경우, 오염 및 프라이머-디머 형성은 거짓 양성 결과를 생성할 수 있다. 비특이적 증폭을 모니터링하고 실시간 PCR 분석의 책임을 높이기 위해 실시간 PCR 분석용 템플릿 및 역전사 없이 컨트롤을 포함하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

STTM 설계를 PVX 벡터에 통합하여 감자내성 miRNAs의 기능을 특성화하기 위해 PVX 기반 miRNA 침묵 시스템을 제시합니다. VbMS 시스템은 식물 종에 걸쳐 매우 보존 된 miRNA 가족인 감자에서 miRNA165/166을 침묵시키는 데 효과적이라는 것이 입증되었습니다.
TM 접근법은 표적 miRNA의 격리 및 그 활동의 체포를 초래하는 miRNA 보충 서열 내의 예상 분열 부위에서 불일치 루프를 생성하도록 설?...

식물 microRNAs (miRNAs)는 20-24 뉴클레오티드 길이의 핵 으로 인코딩 된 규제 RNAs1로 특징 지어지며 성장 및 개발, 광합성 및 신진 대사4,5,6,7, 호르몬 합성 및 신호 8,9, 생물학적 반응 10, 생물학적 및 생물학적 반응을 포함하여 식물 생물학적 과정의 거의 모든 측면에서 근본적인 역할을합니다. 11,12,13, 영양 및 에너지 조절14,15. 식물 miRNA의 규제 역할은 잘 프로그래밍되고 대상 mRNA를 분개하거나 번역하여 전사 후 수준에서 일반적으로 충족됩니다.
감자 16,17,18,19,20,21에서 miRNAs의 식별, 전사 프로파일링 및 표적 예측을 향한 엄청난 진전이 이루어졌습니다. 그러나 감자를 포함한 식물에서 miRNAs의 기능적 특성화는 효율적이고 높은 처리량 유전 적 접근법의 부족으로 인해 다른 유기체보다 뒤쳐졌습니다. 대부분의 miRNAs는 상당한 유전 중복을 가진 가족에 속하기 때문에, 기능 분석의 표준 손실에 의해 개별 miRNA의 기능 분석을 수행하는 것은 도전적입니다222. 또한, 단일 miRNA는 다중 표적 유전자23 및 여러 상이한 miRNA를 제어할 수 있어 동일한 분자 경로를 공동으로 조절할 수 있다24,25. 이러한 특성은 특정 miRNA 또는 miRNA 제품군의 기능을 특성화하기 어렵게 만듭니다.
miRNAs의 기능 적 분석의 대부분은 명백한 한계가있는 기능의 이득 접근 방식에 크게 의존했습니다. 상기 인공 miRNA(amiRNA) 방법은 내인성 1차 성적증명서(pri-miRNAs)를 높은 수준에서 생성하여 표적 유전자 발현의 억제로 이어집니다26,27,28,29. 그러나, 강력한 구성 35S 프로모터를 이용한 활성화 태깅 및 miRNA 과발현은 종종 생체 내 조건을 대표하지 않는 miRNAs의 고조된 발현으로 이어지므로 miRNAs30의 내인성 기능을 반영하지 않을 수 있다. 결합 및/또는 분열 부위에 항만 돌연변이를 포함하는 미RNA 내성 형태의 표적 유전자의 발현을 포함하는 대안적인 접근법이 개발되었다31,32,33. 그러나 이 접근법은 또한 잠재적으로 형질화 성 유물로 인해 miRNA 내성 표적 트랜스진에서 파생된 표현형의 오해를 일으킬 수 있다. 따라서 이러한 기능 의 이득 연구에서 결론주의34 그려야 한다. 위에서 설명한 접근 방식의 또 다른 주요 제한사항은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 변환이 필요하다는 것입니다. 또한, 트랜스진 의존성 접근법은 변성 식물 종에 거의 적용되지 않습니다. 따라서 miRNAs의 기능을 해명하기 위해 빠르고 효율적인 기능 상실 접근 법을 개발하는 것이 필수적입니다.
변환 절차의 전제 조건인 바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 표적 모방(TM) 전략을 바이러스 유래 벡터와 결합하여 확립되었다. VbMS 시스템에서 인공 적으로 설계된 TM 분자는 바이러스 백본에서 일시적으로 발현되어 강력한 고처리량 및 시간 절약 도구를 제공하여 식물 내인성 miRNAs35,36의 기능을 해부합니다. VbMS는 처음에 N에서 개발되었습니다. 담배 딸랑이 바이러스(TRV)35,36,37 을 사용한 벤타미안과 토마토는 감자 X(PVX)38, 면잎 구겨진 바이러스(ClCrV)39, 오이 모자이크 바이러스(CMV)40,412,CWM바이러스(CMV)를 포함한 다양한 바이러스 발현 시스템을 사용하여 아라비도시스, 면, 밀 및 옥수수로 확장되었습니다. , 보리 스트라이프 모자이크 바이러스 (BSMV)44,45.
감자(Solanum tuberosum)는 영양가가 높고 에너지 생산량이 높고 입력 요건이 상대적으로 낮기 때문에 주로 세계에서 가장 중요한 식품 작물이자 가장 널리 재배된 비시리얼 작물입니다. 감자의 몇 가지 특징은 매력적인 이질 모델 식물을 만든다. 그것은 높은 횡단 속도 식물성 전파 폴리 플로이드 작물, 이종성, 유전 적 다양성. 그러나 현재까지 VbMS를 사용하여 감자에서 miRNAs의 기능을 특성화하는 보고서는 없습니다. 여기서는 감자 식물38에서 miRNAs의 기능을 평가하기 위해 리그션 독립적 복제(LIC) 조정 된 감자 PVX 기반 VbMS 접근 방식을 제시합니다. miR165/166 제품군과 대상 mRNA 및 클래스 III 동종 도메인/Leu zipper(HD-ZIP III) 전사 요인이 광범위하게 특징지어졌기 때문에 VbMS 분석방법을 설명하기 위해 miR165/166 제품군을 선택했습니다222,47,48. HD-ZIP III 유전자는 메리스템 발달 및 장기 극성의 주요 조절제이며, miR165/166 기능의 억제는 HD-ZIP III 유전자의 발현이 증가하여 잎 극성의 감소된 어포형 지배력 및 비정상적인 패턴과 같은 흉부 발달 결함의 결과로 22,35,411 . miRNA165/166의 침묵과 상관관계가 있는 쉽게 접할 수 있는 발달 표현형은 PVX 기반 VbMS 분석의 효과를 정확하게 평가할 수 있게 해주다.
이 연구에서는 PVX 기반 VbMS 시스템이 감자에서 miRNAs의 기능을 효과적으로 차단할 수 있음을 보여줍니다. PVX 기반 바이러스 유도 유전자 침묵(VIGS) 시스템은 다수의 감자 품종에 설치되어 있기 때문에49,50,51,52, 이 PVX 기반 VbMS 접근법은 광범위한 디플로이드 및 테트라피드 감자 종에 적용될 가능성이 있다.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;M dATP and 100 &amp;micro;M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td><td>#S0297</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene</td></tr><tr><td>E. coli DH5&amp;alpha;</td><td></td><td></td><td>for the destination constructs generated by LIC cloning</td></tr><tr><td>Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,&lt;br/&gt; Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Pure Ethanol &amp;ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Nano-drop spectrometer: NanoDrop One&lt;sup&gt;C&lt;/sup&gt; Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td><td>Benchtop pH / mV Meter - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS vector: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR reagent: KAPA SYBR&amp;reg; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,&lt;br/&gt; Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzyme: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Soil: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase and buffer</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

potato virus x-based microrna silencing (vbms) in potato.

바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 식물에서 microRNAs(miRNAs)의 기능적 특성화를 위한 신속하고 효율적인 도구입니다. VbMS 시스템은 니코티아나 벤타미안, 토마토, 아라비도시스, 면, 밀과 옥수수 와 같은 모노코트 식물 등 다양한 식물종에 개발 및 적용되었습니다. 여기에서는 PVX 기반 VbMS 벡터를 사용하여 감자내생 내성 miRNAs를 침묵시키기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 특정 miRNA의 발현을 무너뜨리기 위해, 관심 있는 miRNA의 표적 모방(TM) 분자는 설계되고, 식물 바이러스 벡터에 통합되고, Agrobacterium 침투에 의해 감자에 발현되어 내인성 miRNA에 직접 결합하고 그 기능을 차단한다.

도 2 는 정맥을 따라 잎 라미나의 축축측에서 잎 조직의 자궁 내성장을 가진 PVX-STTM165/166 감자 식물(Katahdin)을 나타낸다. 나팔 모양의 잎 형성과 같은 더 심각한 표현형도 관찰되었다. 대조적으로, PVX 대조공장에서는 현상이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 VbMS 시스템이 테트라클로드 감자 식물에서 내인성 miRNA 기능을 억제하는 데 효과적이었으며 PVX-VbMS 시스템은 특정 miRNA ?...

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Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

3.1K 조회수.  Texas A&M University System. 감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

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Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

연구

환경과학

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins with the ability to inhibit the host plant RNA silencing pathway. Unlike virus effector proteins, only several secreted effector proteins have showed the ability to suppress RNA silencing in bacterial, oomycete, and fungal pathogens, and the molecular functions of most effectors remain largely unknown. Here, we describe in detail a slightly modified version of the co-infiltration assay that could serve as a general method for observing RNA silencing and for characterizing effector proteins secreted by plant pathogens. The key steps of the approach are choosing the healthy and fully developed leaves, adjusting the bacteria culture to the appropriate optical density (OD) at 600 nm, and observing green fluorescent protein (GFP) fluorescence at the optimum time on the infiltrated leaves in order to avoid omitting effectors with weak suppression activity. This improved protocol will contribute to rapid, accurate, and extensive screening of RNA silencing suppressors and serve as an excellent starting point for investigating the molecular functions of these proteins.

Here, we present a modified screening method that can be extensively used to quickly screen RNA silencing suppressors in plant pathogens.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

유전학

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

면역학 및 감염병학

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

생물학

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

생화학

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

피 코르 나 바이러스과의 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA-기반 규제

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the injection of maize seedlings near meristematic tissue with Agrobacterium carrying a viral vector. Recombinant foxtail mosaic virus (FoMV) clones engineered for gene silencing and gene expression were used to optimize this method, and its use was expanded to include a recombinant sugarcane mosaic virus (SCMV) engineered for gene expression. Gene fragments or coding sequences of interest are inserted into a modified, infectious viral genome that has been cloned into the binary T-DNA plasmid vector pCAMBIA1380. The resulting plasmid constructs are transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101. Maize seedlings as young as 4 days old can be injected near the coleoptilar node with bacteria resuspended in MgSO4 solution. During infection with Agrobacterium, the T-DNA carrying the viral genome is transferred to maize cells, allowing for the transcription of the viral RNA genome. As the recombinant virus replicates and systemically spreads throughout the plant, viral symptoms and phenotypic changes resulting from the silencing of the target genes lesion mimic 22 (les22)&#160;or&#160;phytoene desaturase (pds) can be observed on the leaves, or expression of green fluorescent protein (GFP) can be detected upon illumination with UV light or fluorescence microscopy. To detect the virus and assess the integrity of the insert simultaneously, RNA is extracted from the leaves of the injected plant and RT-PCR is conducted using primers flanking the multiple cloning site (MCS) carrying the inserted sequence. This protocol has been used effectively in several maize genotypes and can readily be expanded to other viral vectors, thereby offering an accessible tool for viral vector introduction in maize.

An Agrobacterium-based injection (agroinjection) protocol is presented for the inoculation of foxtail mosaic virus&#160;and sugarcane mosaic virusclones into maize seedlings. Inoculation in this manner leads to viral infection, virus-induced gene silencing of marker genes, and viral overexpression of GFP.

재조합 폭스테일 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염 클론주사에 의해 옥수수 묘목의 직접 농경화

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...