Agradecemos ao Dr. Yule Liu, da Universidade de Tsinghua, por fornecer o vetor PVX-LIC. Este trabalho foi apoiado por um fundo inicial da Texas A&M AgriLife Research e do Projeto Hatch TEX0-1-9675 do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA para o JS.

1. Cultivar plantas de batata.
<ol><li>Propagar plantas de batata in vitro em tubos de cultura (25 x 150 mm) com mídia Murashige e Skoog (MS) mais vitamina Gamborg (mistura de sal basal de MS, vitamina Gamborg, 30 g/L de sacarose, 3,5 g/L de ágar, pH = 5,7). Coloque os tubos na sala de crescimento abaixo de 20-22 °C, 16 h de luz/8 h fotoperíodo escuro e intensidade de luz 120 μmol/m2∙s1. NOTA: Novas brotos e raízes normalmente se desenvolvem em 1-2 semanas a partir de plantas. Propagar plantas com mídia de vitaminas ms/Gamborg frescas todos os meses.</li>
	<li>Quatro semanas depois, transplante plantas in vitro no solo e as plante em uma estufa abaixo de 20-22 °C, 16 h de luz/8 h fotoperíodo escuro e intensidade de luz 120 μmol/m2∙s1. NOTA: As plantas com raízes e folhas recém-desenvolvidas são adequadas para transplante. Mantenha a umidade para as plantas recém-transplantadas durante os primeiros 3-4 dias.</li>
</ol>2. Construa os vetores VbMS.
<ol><li>Projete e clone as moléculas TM de tandem curto (STTM, Figura 1)22,53 para o miRNA de interesse. NOTA: Adquira sequências de miRNA com base em dados experimentais ou no banco de dados miRbase54,55,56,57,58,59. A sequência miR166 utilizada neste estudo foi descrita anteriormente60.<ol>
<li>Projete o módulo TM inserindo uma sequência de incompatibilidade, normalmente 5'-CTA-3', na sequência de complemento reverso do miRNA no local correspondente aos nucleotídeos 10-11 do miRNA. NOTA: Por exemplo, a sequência de Stu-miR160 é 5'-UGCCUCUCUCUGUAUGCC-3'61, onde o nucleotídeos 10-11 está em negrito. A sequência de complemento reverso (em desoxinucleotídeos) é de 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' e o local de inserção da protuberância é mostrado em negrito. A sequência de moléculas TM (desoxynucleotide) deve ser de 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.</li>
		<li>Projete primers para clonagem do fragmento STTM (Figura 1). Use oligonucleotídeos de DNA com a sequência espaçadora de 48 nt como modelo para clonagem PCR. O primer dianteiro consiste em um linker LIC1 (5'-CgACgACAAGACCgT-3'), a sequência dianteira do acima projetado para molécula TM e a sequência parcial de 5' do espaçador de 48 nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). O primer reverso consiste em um linker LIC2 (5'-gAggAgAgAgCCgT-3'), a sequência de complemento reverso da molécula TM e um complemento reverso parcial à sequência de 3' do espaçador de 48 nt (5'-ATTCTTCTTTTTTAGACCAT-3'). NOTA: A sequência de espaçadora de 48 nt é de 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAATGGTCTAAGAAGAAGAAT-3'. Por exemplo, para STTM-miR160, o primer para a frente deve ser 5'-CgACgACAAGCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; o primer reverso deve ser de 5'-gAggAgAgAgCcgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTTTTTAGACCAT-3' (Figura 1).</li>
		<li>Amplie o fragmento STTM em um volume de 50 μL por PCR usando o espaçador universal 48-nt sintetizado como modelo e uma polimerase de DNA de alta fidelidade.<ol>
<li>Configure a reação do PCR misturando 0,5 μL de cada primer (40 μM), 0,5 μL de oligo espaçador de 48 nt (40 μM), 5 μL de tampão PCR 10x, 1 μL de mistura dNTP (10 mM cada), 0,1 μL de polimerase de DNA de alta fidelidade (10 U/μL ), e 43 μL de ddH2O a um volume total de 50 μL. Realize a amplificação padrão do PCR da seguinte forma: 94 °C para 3 min, 32 ciclos de 94 °C para 45 s, 60 °C para 45 s e 72 °C para 60 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificar o fragmento STTM por precipitação de etanol. Adicione 2,5 volumes de etanol e 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (pH = 4,0) aos produtos pcr. Misture vigorosamente e centrífuga a 14.000 x g por 10 min. Retire o supernasce e enxágue a pelota com 1 mL de 70% de etanol. Seque a pelota e dissolva-a em 20 μL de ddH2O. NOTA: Use eletroforese de DNA para verificar a amplificação dos produtos PCR STTM.</li>
		<li>Configure a reação de polimerase de DNA T4 no gelo misturando 2,5 μL de produto PCR STTM purificado, 0,5 μL de 10x T4 tampão de polimerase de DNA, 0,05 μL de 1 M dithiothreitol (DTT), 0,25 μL de 100 mM dATP, 0,1 μL de polimerase de DNA T4 (3 U/μL) e 1,6 μL de ddH2O a um volume total de 5 μL. Incubar a mistura a 37 °C por 15 min, e trate os produtos a 75 °C por 20 minutos para inativar a polimerase de DNA T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare a construção VbMS baseada em PVX.<ol>
<li>Digerir 5 μg de plásmid PVX-LIC com 2,5 μL de SmaI (20 U/μL) em um volume de 100 μL.</li>
		<li>Adicione um volume igual de fenol:clorofórmio:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8.0) aos produtos PVX-LIC digeridos e misture vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e transferir o supernatante para um novo tubo centrífuga. Adicione um volume igual de clorofórmio:isopropanol (24:1) e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min. NOTA: O vetor PVX-LIC abriga o LIC para clonagem. O LIC do vetor PVX-LIC contém um gene ccdB e um gene resistente a clororamfenicol e precisa ser mantido/propagado na cepa E. coli DB3.1 usando meio LB contendo kanamycina (50 μg/L) e clororamfenicol (15 μg/L).</li>
		<li>Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga. Adicione 2,5 volumes de etanol e 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (pH = 4,0) e misture vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e remover o supernatante.</li>
		<li>Enxágüe a pelota com 1 mL de 70% de etanol e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e remover o supernatante. Seque a pelota e dissolva o plasmídeo PVX-LIC digerido com 100 μL de ddH2O.</li>
		<li>Configure a reação de polimerase de DNA T4 no gelo misturando 2,5 μL de DNA vetor PVX-LIC digerido, 0,5 μL de 10x tampão de polimerase de DNA T4, 0,05 μL de 1 M DTT, 0,25 μL de 100 mM dTTP, e 0,1 μL de polimerase de DNA T4 (3 U/μL) em um volume total de 5 μL. Incubar a mistura a 37 °C por 15 min e tratar os produtos a 75 °C por 20 min. inativar a polimerase de DNA T4.</li>
	</ol></li>
	<li>Clone a sequência STTM no vetor PVX-LIC usando uma reação LIC. Misture os produtos STTM PCR tratados com DNA T4 (5 μL) e os plasmídeos PVX-LIC tratados com DNA T4 (5 μL). Incubar a 70 °C por 5 min, esfriar até 22 °C em uma rampa de 0,1 °C/s, e manter a 22 °C por 30 min usando uma máquina PCR. NOTA: Estenda o tempo de incubação para durante a noite a 4 °C para obter maior eficiência da clonagem LIC.</li>
	<li>Transforme 5 μL dos produtos de reação LIC no E. coli DH5α e cresça em uma placa LB contendo 50 μg/mL kanamycin62,63. Escolha e verifique colônias positivas por PCR com os primers de clonagem e primer universal para o vetor PVX-LIC seguido de sequenciamento.<ol>
<li>Execute o PCR colônia com o primer dianteiro para PVX-LIC (5'-GTGTTGGCCAAACTAGAT-3') em combinação com o primer reverso para clonagem STTM para identificar clones positivos. O tamanho da banda PCR deve ser de ~300 bp. NOTA: Verifique as sequências de fragmentos STTM por sequenciamento do ciclo do exterminador64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>Isole os plasmídeos PVX-STTM dos clones validados e transforme-os em cepas de Agrobacterium GV3101, GV2260 ou EHA10562,63. Verifique colônias de agrobacterium por PCR. NOTA: Confirme colônias de agrobacterium por PCR usando o primer dianteiro para PVX-LIC e o primer reverso para clonagem STTM.</li>
</ol>3. Realize o ensaio VbMS baseado em PVX em plantas de batata.
<ol><li>Transplante de 4 semanas de idade em plantas de batata in vitro no solo. As plantas transplantadas serão submetidas ao ensaio VbMS 3-4 dias depois.</li>
	<li>Plantas de batata inoculadas com Agrobacterium contendo os plasmídeos PVX-STTM. NOTA: Para o ensaio VbMS na batata, a infiltração mediada por Agrobacterium e a inoculação de arranhões de palito são realizadas simultaneamente.<ol>
<li>Escolha e inocula os transformadores positivos contendo vetores PVX-STTM em 50 mL de LB líquido contendo 50 μg/mL kanamycin e 50 μg/mL rifampicina. Cresça em uma incubadora de 28 °C a 220 rpm por 16 h até OD600 = 1,0.</li>
		<li>Ao mesmo tempo, cruze as colônias positivas de Agrobacterium em pelo menos duas novas placas LB contendo kanamycina de 50 μg/mL e 50 μg/mL rifampicina e crescem a 28 °C por 1 dia. Inclua o vetor PVX-LIC38,66 como controle e PVX-GFP67,68 para monitorar a propagação do vírus.</li>
		<li>Colete a cultura líquida agrobacterium por centrifugação a 3.400 x g por 10 min a temperatura ambiente. Resuspend Agrobacterium células com igual volume de tampão de infiltração (10 mM MgCl2, 10 mM MES e 200 μM acetosyringone, pH = 5,6) e ajustar-se a OD600 = 1,0. Incubar em temperatura ambiente por 6 h.</li>
		<li>Infiltrar-se na cultura Agrobacterium no lado abaxial de folhas totalmente expandidas com uma seringa sem agulha de 1 mL.<ol>
<li>Vire e segure uma folha com uma mão, em seguida, use um dedo para apoiar a folha lamina do lado adaxial no local de infiltração. Mantenha a seringa vertical à superfície da folha com a outra mão e infiltre-se na cultura Agrobacterium no lado abaxial da lamina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raspe a cultura Agrobacterium das placas LB e arranhe a superfície do caule do primeiro ou dois internos das plantas de batata infiltradas com um palito de dente. Coce suavemente a epiderme da haste. Evite perfurar através da haste, o que pode causar danos graves às plantas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cresça as plantas infiltradas a 22 °C com um fotoperíodo escuro de 16 h/8h e intensidade leve de 120 μmol/m2∙ s1 em uma estufa. NOTA: Fenótipos causados pelo silenciamento do miRNA geralmente aparecem em 2-4 semanas pós-incopulsão (Figura 2, Figura 3). Normalmente leva de 10 a 20 dias para que o fenótipo VbMS apareça após a infiltração. O fenótipo VbMS depende das propriedades do miRNA específico e dos genes-alvo específicos, condições de crescimento e variedades de batata.</li>
</ol>4. Realize a análise de expressão.
<ol><li>Quando os fenótipos aparecem em 2-4 semanas pós-inoculação, colete tecidos como brotos, folhas, flores ou raízes com fenótipos das plantas vbMS e tecidos das plantas de controle com tesouras. Isole o total de RNAs dos tecidos coletados.</li>
	<li>Verifique a qualidade do RNA por eletroforese62,63 e quantifique a concentração de RNA medindo a absorvância OD260 com um espectotômetro.</li>
	<li>Use o PCR de transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) para analisar a expressão miRNA.<ol>
<li>Para miRNAs específicos, projete um primer de transcrição reversa de loop-tronco. Os primers RT de loop-tronco contêm uma espinha dorsal universal de 5' e uma extensão de 3' 6-nt de um miRNA específico. Projete uma espinha dorsal universal de 5''- GTCTCCTCTGGTGCaggccgaggtattcGCACCAGAGAGGAGAC-3') que forme uma estrutura de loop-tronco. (A caixa superior corresponde a uma sequência inversa repetida e a minúscula à região do loop).</li>
		<li>Parte da sequência de backbone de 5' que forma um loop serve como primer reverso para amplificação PCR subsequente (sequência em negrito-itálico na sequência backbone). Adicione uma sequência de extensão de 6-nt que seja inversa-complementar ao final de 3' do miRNA de interesse ao primer de loop-tronco para fornecer especificidade para transcrição reversa (Figura Suplementar 1A). NOTA: Projete o primer de transcrição reversa do loop-tronco, conforme descrito por Chen et al.69 e Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Por exemplo, o primer de transcrição reversa de loop-tronco para Stu-miR160 foi projetado como 5'-GTCTCCCTGGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGAGGAGACGGCATA-3'. O primer de transcrição reversa do loop-de-haste para a família batata miR165/166 foi projetado como 5'-GTCTCCCTGGGGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGAGAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (As sequências maiússmenas em negrito fornecem a especificidade da transcrição reversa para miRNAs específicos).</li>
		<li>Configure a reação de transcrição reversa misturando 50-200 ng de RNA total, 1 μL do primer de transcrição reversa de alça-tronco (100 μM), 2 μL de buffer de 10x, 0,2 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 0,25 μL de dNTPs (10 mM cada) e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL) no gelo. Adicione ddH2O sem nuclease a um volume total de 20 μL.</li>
		<li>Realize a transcrição reversa usando o procedimento de transcrição reversa pulsada. Incubar a mistura de reação de transcrição reversa a 16 °C por 30 min, realizar um ciclo de temperatura de 30 °C para 30 s, 42 °C para 30 s e 50 °C para 1 s, para um total de 60 ciclos, e inativar a transcriptase reversa por incubação a 85 °C por 5 min.</li>
		<li>Para análise pcr em tempo real da expressão miRNA, projete o primer dianteiro com base na sequência miRNA, mas não inclua sequências que se sobrepõem com o primer de transcrição reversa de loop de haste projetado acima. Adicione uma extensão de 3-7-nt aos 5' do primer dianteiro para otimizar o comprimento, a temperatura de fusão e o conteúdo gc (Figura Suplementar 1). NOTA: O primer reverso universal é de 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Por exemplo, o primer de transcrição reversa de loop-tronco para Stu-miR160 foi projetado como 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. O primer de transcrição reversa do loop-tronco para a família miR165/166 é 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. As sequências ousadas servem como extensões de 5' para otimização do primer. Os primers de transcrição reversa do loop-tronco e os primers PCR em tempo real para miRNA podem ser projetados usando o miRNA Primer Design Tool73.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintetizar cDNAs dos mRNAs de destino por PCR de transcrição reversa padrão (RT-PCR). Incubar a mistura de reação de transcrição reversa a 37 °C por 60 min e inativar a transcriptase reversa aquecendo a 85 °C por 5 min. NOTA: (1) Prever mRNAs de destino usando o programa psRNATarget74 se os mRNAs de destino não forem conhecidos. (2) O primer de transcrição reversa universal para mRNA é um primer ancorado 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.</li>
	<li>Configure a reação pcr em tempo real tanto para miRNA de interesse quanto para os mRNAs de destino. Misture 0,5 μL de modelo cDNA, 5 μL de 2x tampão PCR em tempo real com verde SYBR, 0,05 μL de cada primer para frente e reverso (40 μM) e 4,4 μL de ddH2O em um volume total de 5 μL no gelo.</li>
	<li>Incubar a 95 °C por 3 min, 40 ciclos de 95 °C para 3 s e 60 °C para 30 s. Realize uma análise subsequente da curva de fusão da seguinte forma: Incubar a 95 °C para 15 s, esfriar até 60 °C em uma rampa de 20 °C/s, manter a 60 °C para 60 s, aquecer a 95 °C em uma rampa de 0,2 °C/s, e manter a 95 °C para 15 s. Analise os valores Ct usando os métodos ΔΔCt76,77 e plote os meios com erros padrão. NOTA: (1) Os primers pcr em tempo real para mRNAs de destino podem ser projetados conforme descrito75. (2) A poliubiquitina de batata 10 pode servir como um controle interno para a normalização na batata. O primer dianteiro para o gene de poliubiquitina de batata 10 é 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' e o primer reverso 5'-TTATTTATTCACATAACAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Para análise de PCR em tempo real, a contaminação e a formação de primer-dimer podem gerar resultados falsos positivos. Para monitorar a amplificação não específica e aumentar a responsabilidade da análise pcr em tempo real, recomenda-se incluir controles sem modelo e transcriptase reversa para ensaios PCR em tempo real.</li>
</ol>

Apresentamos um sistema de silenciamento miRNA baseado em PVX para caracterizar a função de miRNAs endógenos na batata, integrando o design STTM ao vetor PVX. O sistema VbMS mostrou-se eficaz no silenciamento do miRNA165/166 na batata, uma família de miRNA altamente conservada entre espécies vegetais.
A abordagem TM foi desenvolvida para interferir na expressão de miRNAs baseada em uma mímica de alvo miRNA artificial que foi projetada para criar um loop de incompatibilidade no local esp...

As microRNAs (miRNAs) são caracterizadas como RNAs1 regulatórias codificadas por 20 a 24 anos, codificadas por armas nucleares e desempenham papéis fundamentais em quase todos os aspectos dos processos biológicos das plantas, incluindo crescimento e desenvolvimento2,3, fotossíntese e metabolismo4,5,6,7, síntese hormonal e sinalização 8,9, respostas biográficas e abióticas10, 11,12,13, e regulação de nutrientes e energia14,15. Os papéis regulatórios das miRNAs vegetais são bem programados e cumpridos tipicamente em níveis pós-transcrição, apertando ou reprimindo translacionadamente os mRNAs alvo.
Foram feitos enormes progressos na identificação, perfil transcricional e previsão de metas de miRNAs em batata16,17,18,19,20,21. No entanto, a caracterização funcional de miRNAs em plantas, incluindo batata, tem ficado para trás de outros organismos devido à falta de abordagens genéticas eficientes e de alto rendimento. É desafiador realizar a análise funcional do miRNA individual por análise padrão de perda de função, pois a maioria dos miRNAs pertencem a famílias com considerável redundância genética22. Além disso, um único miRNA pode controlar múltiplos genes-alvo23 e vários miRNAs diferentes podem modular a mesma via molecular de forma colaborativa24,25. Essas propriedades dificultam a caracterização da função de um miRNA específico ou de uma família miRNA.
Grande parte da análise funcional das miRNAs tem se apoiado fortemente em abordagens de ganho de função que têm limitações óbvias. O método artificial miRNA (amiRNA) explora as transcrições primárias endógenas (pri-miRNAs) para produzir miRNAs em alto nível, levando à inibição da expressão genética alvo26,27,28,29. No entanto, a marcação de ativação e a superexpressão do miRNA usando um forte promotor 35S constitutivo muitas vezes levam a uma expressão aumentada de miRNAs que não são representativas de condições in vivo e, portanto, podem não refletir a função endógena do miRNAs30. Uma abordagem alternativa foi desenvolvida envolvendo a expressão de formas resistentes ao miRNA de genes-alvo que contêm mutações impuros nos locais de ligação e/ou decote31,32,33. Mas essa abordagem também pode potencialmente causar má interpretação do fenótipo derivado do transgene alvo resistente ao miRNA devido a artefatos transgênicos. Portanto, as conclusões desses estudos de ganho de função devem ser tomadas com cautela34. Outra grande limitação das abordagens acima descritas é que elas requerem transformação, que é intensiva em mão-de-obra e demorada. Além disso, as abordagens dependentes de transgene dificilmente são aplicáveis para espécies de plantas recalcitrantes de transformação. Portanto, é essencial desenvolver uma abordagem rápida e eficiente de perda de função para desvendar a função dos miRNAs.
Para contornar o pré-requisito do procedimento de transformação, o silenciamento microRNA baseado em vírus (VbMS) foi estabelecido combinando as estratégias de imitação de alvo (TM) com vetores derivados do vírus. No sistema VbMS, moléculas de TM projetadas artificialmente são expressas transitoriamente a partir de uma espinha dorsal do vírus, oferecendo uma poderosa ferramenta de alta produtividade e economia de tempo para dissecar a função de miRNAs 35,36 endógenos vegetais. O VbMS foi inicialmente desenvolvido em N. benthamiana e tomate com o vírus do chocalho de tabaco (TRV)35,36,37 e foi estendido para Arabidopsis, algodão, trigo e milho usando vários outros sistemas de expressão de vírus, incluindo o vírus da batata X (PVX)38, o vírus do crumple da folha de algodão (ClCrV)39, o vírus do mosaico de pepino (CMV)40,41,42, vírus do mosaico de trigo chinês (CWMV)43 , e o vírus do mosaico de listras de cevada (BSMV)44,45.
A batata (solanum tuberosum) é a quarta cultura alimentar mais importante e a cultura noncereal mais cultivada noncereal no mundo principalmente devido ao seu alto valor nutricional, alta produção de energia e requisitos relativamente baixos de insumos46. Várias características da batata fazem dele uma planta modelo dicotyledonous atraente. É uma cultura poliploide propagada vegetativamente com alta taxa de cruzamento, heterozigosidade e diversidade genética. No entanto, até o momento, não há nenhum relatório caracterizando a função de miRNAs na batata usando VbMS. Aqui, apresentamos uma clonagem independente de ligadura (LIC) adaptada à batata VbMS baseada em VbMS para avaliar a função de miRNAs em plantas de batata38. Selecionamos a família miR165/166 para ilustrar o ensaio VbMS porque a família miR165/166 e seus mRNAs alvo e os fatores de transcrição de homeodomína/leu classe III (HD-ZIP III) foram amplamente caracterizados22,47,48. Os genes HD-ZIP III são os principais reguladores do desenvolvimento de meristem e polaridade de órgãos, e a supressão da função miR165/166 leva ao aumento da expressão dos genes HD-ZIP III, resultando em defeitos de desenvolvimento pleotrópico, como a redução da dominância apical e padrões aberrantes de polaridade de folhas222,35,38,41 . Os fenótipos de desenvolvimento facilmente escoráveis correlacionados com o silenciamento do miRNA165/166 permitem uma avaliação precisa da eficácia do ensaio VbMS baseado em PVX.
Neste estudo, demonstramos que o sistema VbMS baseado em PVX pode efetivamente bloquear a função de miRNAs na batata. Como o sistema de silenciamento genético induzido por vírus (VIGS) baseado em PVX foi estabelecido em várias variedades de batata49,50,51,52, essa abordagem VbMS baseada em PVX pode provavelmente ser aplicada a uma ampla gama de espécies de batata diploide e tetraploide.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="691">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">100 &#181;M dATP and 100 &#181;M dTTP</td>
			<td style="width:188px;">Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td>
			<td style="width:120px;">TQAC136</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">3 M Sodium acetate, pH 4.0.</td>
			<td style="width:188px;">Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td>
			<td style="width:120px;">#S0297</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">D2666-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chloroform</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0757-950ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">D0798-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DTT</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0281-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">E. coli DB3.1</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">E. coli DH5&#945;</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td>for the destination constructs generated by LIC cloning</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td>
			<td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td>
			<td style="width:120px;">G99260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs</td>
			<td style="width:188px;">Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, 
			Wilmington, MA, USA</td>
			<td>7958960001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0944-1L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Koptec Pure Ethanol &#8211; 200 Proof</td>
			<td style="width:188px;">Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td>
			<td style="width:120px;">V1005M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MES</td>
			<td style="width:188px;">TCI America, Portland, OR 97203, USA</td>
			<td style="width:120px;">M0606-250G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MgCl2</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">MFCD00149781</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">M-MuLV Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0253L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">ND-ONEC-W</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System</td>
			<td style="width:188px;">Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td>
			<td style="width:120px;">170-9703</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td>
			<td style="width:120px;">950030010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">pH meter</td>
			<td style="width:188px;">Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td>
			<td style="width:120px;">Benchtop pH / mV Meter - 860031</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.</td>
			<td style="width:188px;">VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td>
			<td style="width:120px;">VWRV0883-400ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phytagel: Gellan Gum</td>
			<td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td>
			<td style="width:120px;">J63423-A1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVX VIGS vector: PVX-LIC</td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:167px;">Zhao et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:188px;">ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td>
			<td style="width:120px;">4485697</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Real-time PCR reagent: KAPA SYBR&#174; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td>
			<td style="width:188px;">Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, 
			Wilmington, MA 01887, USA</td>
			<td style="width:120px;">7959389001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Restriction enzyme: SmaI</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td>R0141S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix</td>
			<td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td>
			<td style="width:120px;">95107-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td>
			<td style="width:188px;">Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td>
			<td style="width:120px;">SKU: D3485-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">RNase Inhibitor Murine</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0314L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">RNAzol RT</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td>
			<td style="width:120px;">R4533</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Soil: Metro-Mix 360</td>
			<td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td>
			<td style="width:120px;">Metro-Mix 360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">T4 DNA polymerase and buffer</td>
			<td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td>
			<td style="width:120px;">M0203S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

potato virus x-based microrna silencing (vbms) in potato.

O silenciamento de microRNA baseado em vírus (VbMS) é uma ferramenta rápida e eficiente para caracterização funcional de microRNAs (miRNAs) em plantas. O sistema VbMS foi desenvolvido e aplicado para várias espécies vegetais, incluindo Nicotiana benthamiana, tomate, Arabidopsis, algodão e plantas monocotas, como trigo e milho. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado usando vetores VbMS baseados em PVX para silenciar miRNAs endógenas na batata. Para derrubar a expressão de um miRNA específico, moléculas de mímica-alvo (TM) de miRNA de interesse são projetadas, integradas em vetores de vírus vegetais, e expressas em batata pela infiltração de Agrobacterium para se ligar diretamente ao miRNA endógeno de interesse e bloquear sua função.

A Figura 2 mostra as plantas de batata PVX-STTM165/166 (Katahdin) com crescimento ectópico de tecidos de folhas do lado abaxial da folha de lamina ao longo das veias. Fenótipos mais severos, como a formação de folhas em forma de trompete, também foram observados. Em contraste, não foi observada anormalidade fenotípica nas plantas de controle PVX. Esses resultados mostram que o sistema VbMS foi eficaz na supressão da função miRNA endógena em plantas de batata tetraploide e o sistem...

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Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Apresentamos um protocolo detalhado para o sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus de batata X (PVX) para caracterizar funcionalmente microRNAs endógenas (miRNAs) na batata. As moléculas de mímica alvo (TM) de miRNA de interesse são integradas ao vetor PVX e transitavelmente expressas na batata para silenciar a família miRNA ou miRNA alvo.

Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

3.0K visualizações.  Texas A&M University System. Apresentamos um protocolo detalhado para o sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus de batata X (PVX) para caracterizar funcionalmente microRNAs endógenas (miRNAs) na batata. As moléculas de mímica alvo (TM) de miRNA de interesse são integradas ao vetor PVX e transitavelmente expressas na batata para silenciar a família miRNA ou miRNA alvo.

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Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Otimizar Configurações de gases de combustão para promover o crescimento de microalgas em fotobiorreatores via simulações de computador

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Ambiente

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

EPA Método 1615. A medição do Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. II. De ensaio total de Vírus cultiváveis

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Um flexível baixo custo sistema hidropônico para avaliar as respostas de planta para pequenas moléculas em condições estéreis

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Deteção de tilápia Lago vírus usando convencional RT-PCR e SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Ensaios foliares destacados para simplificar estudos de expressão gênica em batata durante a infestação por mastigação de insetos Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimativa do índice de área foliar usando três métodos distintos em stands deciduous puros

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating a knowledge gap. To meet the challenge of improving crops to feed the growing global population, this gap must be bridged.
Physiological traits are considered key functional traits in the context of responsiveness or sensitivity to environmental conditions. Many recently introduced high-throughput (HTP) phenotyping techniques are based on remote sensing or imaging and are capable of directly measuring morphological traits, but measure physiological parameters mainly indirectly.
This paper describes a method for direct physiological phenotyping that has several advantages for the functional phenotyping of plant&#8211;environment interactions. It helps users overcome the many challenges encountered in the use of load-cell gravimetric systems and pot experiments. The suggested techniques will enable users to distinguish between soil weight, plant weight and soil water content, providing a method for the continuous and simultaneous measurement of dynamic soil, plant and atmosphere conditions, alongside the measurement of key physiological traits. This method allows researchers to closely mimic field stress scenarios while taking into consideration the environment&#8217;s effects on the plants&#8217; physiology. This method also minimizes pot effects, which are one of the major problems in pre-field phenotyping. It includes a feed-back fertigation system that enables a truly randomized experimental design at a field-like plant density. This system detects the soil-water-content limiting threshold (&#952;) and allows for the translation of data into knowledge through the use of a real-time analytic tool and an online statistical resource. This method for the rapid and direct measurement of the physiological responses of multiple plants to a dynamic environment has great potential for use in screening for beneficial traits associated with responses to abiotic stress, in the context of pre-field breeding and crop improvement.

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&#8211;Environment Interactions

This high-throughput, telemetric, whole-plant water relations gravimetric phenotyping method enables direct and simultaneous real-time measurements, as well as the analysis of multiple yield-related physiological traits involved in dynamic plant&#8211;environment interactions.

Uma plataforma telemétrica e gravimétrica para fenotipagem fisiológica em tempo real de interações vegetais-ambientais

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating ...