Protein sentezi oranı hastalık ve yaşlanma sırasında tedirgin. Fotobeyaztma veya FRAP sonrası floresan geri kazanımı, in vivo protein sentezi oranının ölçülmesine olanak sağlar. Biz fotobeyazrlama sonra yeni protein sentezini izlemek için bir model olarak, GFP ifade şeffaf C.elegans solucanlar kullanın.
Yaygın olarak ifade edilen veya belirli hücre veya dokularda farklı organizatörler altında GFP ifade transgenik solucanlar kullanarak floresan iyileşmesini ölçmek için pratik kurallar salıyoruz. Ayrıca, bu yöntem gerçek zamanlı olarak protein sentezi hızı izleme sunuyor. Yabani tip ve mutant transgenik nematodların gelişim aşamalarını ve büyümesini değerlendirmek için bir diseksiyon stereomikroskop kullanın.
E.coli ile tohumlanmış nematode büyüme medya plakaları üzerine istenilen floresan muhabiri taşıyan vahşi tip ve mutant transgenik hayvanların 10 L4 larvaseçin. Kuluçka ve 20 santigrat derece standart sıcaklıkta nematodlar büyümek. Dört gün sonra, plaka transgenik solucanların karışık bir popülasyon içerir.
Taze tohumlu OP50 NGM plakalarında her bir suştan 15 Adet L4 larva seçin ve aktarın. FRAP tayini yapın ve yetişkinliğin ilk gününde protein sentezhızını izleyin. Ertesi gün, olumlu bir kontrol olarak siklohekamid içeren NGM plakaları hazırlamak ve kullanın.
UV ışığı ile 15 dakika boyunca tohumlu NGM plakaları maruz bırakarak bakterileri öldürün. Agar hacminde mL son konsantrasyonbaşına çok 500 mikrogram bakteriyel tohumlu plakaların üstüne siklohekmid ekleyin. Tabakların kurumasını bekleyin.
Araç ve siklohekmid içeren plakalarda GFP ifade eden transgenik nematodların transferi. Hayvanları standart sıcaklıkta 20 santigrat dereceye kadar iki saat kuluçkaya yatırın. Bir günlük yetişkin transgenik hayvanları, merkezde 20 mikrolitre OP50 damlaile tohumlanmış tek tek NGM plakalarına toplayıp aktarın.
Kapağı çıkarın ve her plakayı epifloresan mikroskobun 20H objektif lensin altına yerleştirin. Fotobeyaztlamadan önce bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın. Photobleach her örnek için 10 dakika.
Fotobeyaztlama dan sonra bir görüntü yakalayın. Hayvanları tek tek NGM plakalarında tutun ve onları kurtarın. Epifloresan stereomikroskopta en az altı saat boyunca her floresan muhabirin iyileşmesini en az altı saat boyunca görüntüleyin ve kaydedin.
Hazırlamak 2% agarose pedleri, ve agarose ped merkezinde M9 tampon 10 mikrolitre damla ekleyin. Pan-nöronal sitoplazmik GFP'yi ifade eden beş transgenik nematodun bir damla M9 tamponuna aktarılması. Sıvı yaymak için bir kirpik kullanın.
Hayvanlar agar içine M9 absorbance nedeniyle iki dakika içinde azaltılmış hareketleri görüntüler. Kirpik çekme kullanarak nematodun konumunu değiştirin. Numuneyi kapak fişi kullanmadan epifloresan mikroskobun 40H objektifine yerleştirin.
Bir referans görüntüsünü odaklayın ve yakalayın. Photobleach 90 saniye için ilgi hedeflenen bir alan. Fotobeyaztlama dan sonra bir görüntü yakalayın.
Fotobeyaztlanmış nematodlara 10 mikrolitre lik m9 tamponu ekleyin. Hayvanların beş dakika lığına iyileşmesine izin verin. Nematodları merkezde 20 mikrolitre OP50 damla ile tohumlanmış tek tek NGM plakaları aktarmak için kirpik aşur veya bir pipet kullanın.
Epifloresan stereomikroskop altında her bir saat içinde her numunenin bir görüntüsünü yakalayın. Fe-2 promotörü kullanılarak somatik dokuları boyunca sitoplazmik GFP ifade eden yabani tip ve fe-2 mutant solucanlar önce karşılaştırıldı, fotobeyazrlama hemen sonra, ve beş saat sonrası kurtarma. Fe-2 mutantları minis kurtarma kapasitesine sahip ken vahşi tip hayvanlar tamamen kurtarıldı.
Böylece yabani tip solucanlar fotobeyazlatma sonrası normal protein sentezini başlatırken, mRNA çeviri başlatma faktörü fe-2'den yoksun solucanlar bunu yapamazlar ve floresan iyileşme oranının in vivo protein sentezoranını gösterdiğini gösterir. Siklohekmid, mRNA çevirispesifik bir inhibitörü protein çeviri inhibisyonu için pozitif bir kontrol olarak kullanılabilir. Gerçekten de, sitoplazmik GFP'yi promotör altında ifade eden siklohekamid ile tedavi edilen transgenik hayvanlar fotobeyaztlama üzerine floresanlarını geri kazanamazlar.
mRNA işleme organları protein çevirisi oranını etkiler. GFP pan-nöronsal olarak ifade eden yabani tip ve edc-3 mutant nematodlar, baş bölgesinde hedeflenen fotobeyaztlama sırasında iyileşme kapasiteleri incelendi. Floresan geri kazanımı, edc-3-eksikliği olan hayvanlarda yabani solucanlara göre çok daha yavaştır.
Protein sentezi modülasyonu organizmahomeostaziçin gereklidir. Yaşlanma sırasında, küresel yanı sıra spesifik protein sentezi tedirgin. Protein çeviri dengesi doğrudan yaşlanmayı ve yaşlanmayı kontrol eder.
Özellikle, çeviri makinelerinin temel bileşenleri ve P-vücut etkileşen bileşenleri yaşlanma sürecini hızlandırır. Çeviri nin algılanması yaşlanmayı uzatır. Bu nedenle, FRAP ile küresel protein sentezi oranlarının ölçülmesi yaşlanma sürecinin doğrudan bir okumasidır.
