Drosophila'yı sirkadiyen zamanları tanımlamak için senkronize etmek, biyolojik saati kontrol eden ya da buna yanıt veren olayları incelemenin ilk adımıdır. Tüm modellerin senkronizasyonu aynı temel yaklaşımı izleyecektir. Bu pratik yapmak için birçok adım vardır ve hepsini bir araya koymak için ezici görünebilir.
Doğal hissetmeden önce birkaç kez denemek için bekleyin. Sıcaklıkları sabit tutun ve üç dakika adımlar boyunca ışık söndürmek istiyorum. Malzemeler eklenir gibi karıştırma, 121 santigrat derece bir Crock-Pot sinek gıda hazırlayın.
Crock-Pot kapak ve her 10 dakikada bir içeriğini karıştırma, bir haddeleme kaynatın içeriğini getirmek. Bir haddeleme kaynatın 20 dakika sonra, ısı kapatın ve Crock-Pot su 83,6 mililitre ekleyin. Yiyecekler soğudukça kapağı kapalı bırakın.
Gıda soğurken, bir film üstüne oluşturmak için izin önlemek için her 10 dakikada bir karıştırın. Ayrıca bir cam termometre ile her 10 dakikada bir sıcaklığı ölçün. Gıda 60 santigrat derecenin altına soğuduktan sonra, el yazmasında açıklandığı gibi Tegosept ve propiyonik asit ekleyin.
İyice karıştırın ve 60 santigrat dereceden sadece birkaç derece daha az bir sıcaklık korumak için Crock-Pot ayarlayın. Sinek gıda dağıtmak için bir peristaltic pompa kullanın. Dar şişeler için, pompa 10 mililitre, ve altı ons kare alt şişeler için, pompa 60 mililitre.
Yaklaşık 200 pupa şişenin iç bağlı olana kadar, 10 ila 12 gün boyunca 25 santigrat derecede santigrat de saklayın. Yetişkinleri şişeden çıkarmak için, onları yeni bir şişeye getirin ve kalan yetişkinleri içeri itmek için sıfır numaralı boya fırçasının donuk ucunu kullanın. Kullanmadan önce ve sonra boya fırçasını %70 etanol ile silin.
Bir sonraki neslin ortaya çıkması için pupaları 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Üç gün sonra sinekler sıfır-üç günlük olacak. Unutmayın ki sıcaklık, ışık ve hatta yemek seçiminiz bile eğitimi etkileyecektir.
Bunları, deneme sırasında her kontrol tutmak için emin olun. Toplama için belirlenen zaman noktalarında, sinekleri hareketsiz hale getirmek için karbondioksit anestezi pedi kullanın ve 100 erkek ve 100 dişi toplayın. Dişi sinekler erkeklerden çok daha büyüktür.
Sinekler de genital inceleyerek ayırt edilebilir. Erkeklerde koyu yuvarlak cinsel organlar, dişilerde ise daha açık ve sivri cinsel organlar vardır. Erkekleri ve dişileri şişe başına 100 dişi ve şişe başına 50 erkek olmak için ayrı şişelere yerleştirin.
Erkek sosyal etkileşimleri bir şişe de 100 kişi olduğunda birçok ölüme yol açar. Sirkadiyen entrainment gerçekleşmesi ni sağlamak için, üç ila beş gün boyunca Hafif düzenlenmiş kuvözler şişeleri yerleştirin. Gelecekteki eğitim için sinek üretmek için, kalan dişilerin 25'ini, kalan erkeklerden 5-7'sini de yeni bir şişeye yerleştirin.
Şişeyi 25 derecede kuluçkaya yatırın. Toplanacak her 100 sinek için. Fiksatif 4.8 mililitre ekleyerek dar bir şişe hazırlayın.
Dar şişeleri bir kova buza yerleştirin ve kovayı, kağıt havluları, folyoyu ve bandı kuvöze götürün. Sinekleri toplamak için, dar şişe bir huni yerleştirin, sonra sinek şişesinden kapağı kaldırmak ve hızlı bir şekilde huni içine ters. Sinekleri fiksatif şişeye yönlendirmek için hafifçe dokunun.
Erkekleri toplarken, 50 sinekiki şişe bir dar şişe içine birleştirin. ZT13 ve ZT19 şişelerini folyoya sarın. Sinekleri aktardıktan sonra, dökülmeyi önlemek için kapakları yerine bantlayın.
Şişeleri 165 RPM ve dört santigrat derecede, dört saat boyunca Nutating Mikseri'ne yerleştirin. Sinekler artık ışığa duyarlı değildir, bu yüzden, folyo sineklerin fiksatif batık olduğunu doğrulamak için kaldırılabilir. Nutating Mikseri'nden şişeleri çıkardıktan sonra formaldehiti çıkarın, ardından sinekleri 3000 mikrolitre 1X PBS ile üç kez yıkayın ve her yıkama sırasında şişeyi ters çevirin.
Gelecekte immünofloresans beklemek için, dört santigrat derece şişeleri saklayın. Işık ve karanlık sirkadiyen döngülere sinek ler eğitmek için kullanılmıştır. Entrainment immünoblotting ile doğrulandı, ve dönem protein immünofloresan analizi, sirkadiyen entrainment için bir belirteç.
Entrained sinek lerin kafalarından hazırlanan tüm hücre ekstrelerinin immünoblotlanması, dönem protein hareketliliği ve yoğunluğunun kanonik bir modelini gösterir. ZT1'de toplanan entrained beyinlerin immünororesans, karakteristik desen dönem proteinlerini gösterir. Bu yöntem, immünofloresan, immünopplotting, immünoprepitasyon, davranış analizi ve biyolojik saat kene olarak yol değişiklikleri nasıl karşılaştırmak için kullanmak isteyebilirsiniz diğer teknikler için bir atlama noktasıdır.
Model organizmanızı eğitme yeteneğiile, en sevdiğiniz yolun zaman içinde değişip değişmediğini ve en sevdiğiniz yoldaki etkilerin biyolojik bozulmaya yol açıp açmayacağını sorabilirsiniz. Biyolojik saat bozulduğunda bir takım hastalıklar kötüleşir. Altta yatan mekanizmaların belirlenmesi bize alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi hastalıklardan muzdarip insanlar için daha etkili ilaçlar oluşturmanıza yardımcı olacaktır.
