Sivrisinek midgut konak metabolizma, üreme, fitness ve veteriner yetkinliğini etkileyen mikropların karmaşık bir topluluk barındırır. Her bağırsak mikrobu ile farklı bir etkisi vardır. Bu video, her bakteri suş veya konak fizyolojisi ilgili rolünü incelemek için prosedür tanıttı.
Bağırsak bakteri kolonileri bir kültür elde etmek için, steril koşullar altında sivrisinek midgut incelemek. Diseksiyon midgut zemin, serotologinate, ve agar plaka üzerine yayıldı. Plakadan tek koloniler seçin ve 16 SRNA gen dizilimi ile bakteri türlerini tanımlayın.
Bağırsak mikrobiyota kaldırmak için üç gün üst üste antibiyotik içeren COD Kabartma ile sivrisinek beslemek. Antibiyotik tedavisinin etkinliği sonraki aşırılık yanlıları öncesinde koloni oluşturan birim test için aseptik sivrisinek midgut diseksiyon tarafından teyit edilebilir. Daha sonra daha önce oral beslenme tsay yoluyla sivrisinek bağırsağı izole belirli bakteri türlerini yeniden tanıtmak.
Bakterilerin konak fizyolojisi üzerindeki etkisi tedavi edilmeyen sivrisinekler, antibiyotik le tedavi edilen sivrisinekler ve sivrisinekler özel kısıtlamayı yeniden ortaya atarak değerlendirilebilir. Midgut diseksiyon ve ekilebilir bakteri izolasyonu. Başlamak için, bir aspiratör ve hücre toplama kutusunda sivrisinek ile kafeste sivrisinek toplamak.
3-5 dakika 4 derecelik bir sıcaklığa maruz kalarak sivrisinekanestezi. Sivrisinekler bir buz soğuk Petri kabına yerleştirerek anestezi tutun. Tezgahı dezenfekte edin, mikroskobu inceleyin ve çevreden gelen bakterilerin kirlenmesini önlemek için %75 etanol püskürtün.
Yüzey üç dakika boyunca% 75 etanol onları bantlama ve sallayarak sivrisinek sterilize ve PBS tampon ile iki kez durulayın. PBS damla içeren steril bir cam slayt üzerinde ayrı ayrı sivrisinek ikiye bölün. Dikkatle bacaklar, kanatlar ve sivrisinek baş forceps kullanarak kaldırın.
Kenetsivrisinek göğüs ve karın son bölümü forceps ve sindirim sistemi izole etmek için ayrı çekin. Sindirim sisteminden ürün ve malpighian tüp kaldırmak için forceps kullanın. Ürün şekerli su yutularak sonra midgut ve şişkinlik pnterior yerle bir edilir.
Malpighian tüpleri midgut ve hindgut kavşağında ince boşaltım tüpleri grubudur. 200 mikrolitre steril PBS tampon ile EP tüpü içine diseksiyon makyaj yerleştirin ve temiz tezgah içinde steril taşlama papaz ile eziyet. Tahıl LB agar plaka ve umutsuz plaka için her sanrı 50 mikrolitre de üç tempo sanrılar homojen yüklemek için.
Tek koloniler uygun olana kadar plakayı 1-2 gün boyunca 37 derece olarak kuluçkaya yatırın. 50 mililitrelik lb sütyen orta içeren 150 mililitrekonik şişe içine tek koloniler seçin. bir gecede 37 derece de bakteri sallamak.
Türlerin tanımlanması. Bakteriyel genomik DNA konstrüksiyon kiti ile TOTO DNA ayıklayın ve PCR tarafından 16 SRDNA yükseltin. Ambrose jel elektroforezi ve sürülme kiti ile PCR ürünlerinden DNA parçalarının geri kazanımı ve saflaştırılması.
Elde edilmiş bakteri zinciri dizilerine sahip olmak için saflaştırılmış DNA parçaları üzerinde DNA dizilimi yapıldı. Bakterilere, arkelere ve veritabanına karşı bakterileri tanımlayan 16 SRNA gen dizisini sorgulayarak patlama araması yapın. Tür düzeyine tanımlama, en yakın takım banka girişine %99 16 SRDNA dizi benzerliğinden daha büyük veya eşit olarak tanımlanmıştır.
İzole, 16 SRDNA sekansı olduğunda, benzerlik %99'dan daha az ve %95 antibiyotik tedavisi ve bakterinin yeniden girişine eşit olduğundan veya eşit olduğunda buna karşılık gelen cinse atanmıştır. bize hazırlamak için sakaroz penisilin ve streptomisin gerekli miktarda tartmak 10% sakaroz çözeltisi, penisilin 20 adet ve mililitre başına streptomisin 20 mikrogram çalışıyor da dahil olmak üzere. Antibiyotik içeren sakaroz çözeltisi pamuk topları sızın ve sivrisinek içeren kağıt fincan üstüne yerleştirin.
Bir deniz kıyısının buharlaşmasını önlemek için pamuk topun üzerini 10 santimetrelik Petri kabıile kapatın. Pamuk topları günde iki kez değiştirin ve üç gün üst üste sivrisinek beslemek. Sivrisinekler iki gruba ayrılır.
İlk grup herhangi bir tedavi olmadan bir sivrisinek fincan yerleştirildi, herhangi bir pamuk topları doktor ile 10%Yani çapraz günlük verildi. İkinci grup antibiyotik tedavisi gördü ve üç gün boyunca hizmet etti. Her grupta, Sergei sivrisinekleri kesildi.
Mika toplam DNA ekstraksiyonu için çıkarıldı ve QPCR evrensel bakteri astarları kullanılarak yapıldı, şekil bir kontrol grubu ve antibiyotik tedavi grubunda 16 SRNA ifadesini gösterir. Sonuçlar penisilin ve streptomisin maliyeti veya gerçekleştirilmesi başarılı olduğunu göstermektedir. bakteriyel çözelti hazırlamak, bir spektrofotometre ile virüs bir bakteri çözeltisi ölçer, EP tüpü içine bir OT bakteri süspansiyon ekleyin.
Santrifüj süspansiyon 5, 000 RCA dört derece de beş dakika için supernatant atın, steril PBS tampon ile bakteri palet çalışır yıkayın. Yeniden 200 mikrolitre steril PBS tampon ile bakteriyel palet askıya 600 mikrolitre, 10%sakaroz çözeltisi, 200 mikrolitre ATP ve 200 mikrolitre bakteriyel süspansiyon yeni bir AP tüp içine ekleyin ve iyice karıştırın. Alternatif olarak, bakteri kan aktive ısı yeniden askıya alınabilir.
Isıtıcı aktif kan hazırlanması. antikoagülan tüp ile pıhtı taze kan, taze kan 2-3 mililitre almak. plazma ve kan hücrelerini ayırmak için dört derece 10 dakika 1000 santrifüj.
Yeni bir EP tüp içine plazma toplamak ve burada bir saat için 56 derece aktive aktive. Steril PBS tampon ile kez boyunca Wash Blast ev. Isıtma aktif plazma ile patlayıcı ev durula.
Membran ve besleme sistemini birleştirin. Film hastalığını en üst düzeyde çekin. plastik halka ve işyeri parafilm yavaş yavaş besleyici ünitesine hazırlanan bakteriyel çözüm eklemek sızıntısını önlemek için düzeltmek, maksimum cüzdan.
Kabarcık önlemek için bir yönden düştü ve besleyici birimi mühür. Güç kaynağını bağlayın. Sıcaklık 37 dereceye ulaşana kadar bekleyin besleyici üzerine bakteri çözeltisi ile besleyici ünitesi yüklü.
Bakteri sivrisinek besleme den önce antibiyotik metabolize etmek için 24 saat boyunca durdurulmalıdır. Sivrisinek ile kağıt bardak üzerinde besleme ünitesi için, daha sonra 90 dakika besleme izin verin. Tam olarak teşvik sivrisinek daha fazla çalışma için seçilebilir.
Temsili sonuçlar. İkinci şekil bize sivrisinek başına ortalama övgüyü gösteriyor. Antibiyotik retosyonu sivrisinektedavi sonra meningosepticum bakın.
Şekil 3, C meningosepticum içeren kan yemekten 24 saat sonra varyant gelişimi ile ilgili genlerin ekspresyonunu göstermektedir. Sonuçlar, kontrol grubunun yumurta üretiminde ve solma grubunda önemli bir değişiklik olmadığını göstermektedir. Bakteri veya antibiyotik tedavi sivrisinek ile bir beslenme kompozisyon ilgi için teşekkür ederiz.
