Mosquito midgut abrite une communauté complexe de microbes qui affectent le métabolisme de l’hôte, la reproduction, la forme physique et la compétence vétérinaire. Avec chaque microbe intestinal est un effet différent. Cette vidéo présente la procédure d’étude du rôle respectif de chaque souche bactérienne ou physiologie de l’hôte.
Pour acquérir une culture de colonies bactériennes intestinales, disséquez le mystique midgut dans un état stérile. Broyez le midgut disséqué, sérorotologinate, et étalé sur la plaque d’agar. Choisissez des colonies simples dans la plaque et identifiez les espèces bactériennes par l’intermédiaire de leur séquence de 16 gènes SRNA.
Nourrissez les moustiques avec des gaufrages COD contenant des antibiotiques pendant trois jours consécutifs pour enlever le microbiote intestinal. L’efficacité du traitement antibiotique peut être confirmée en disséquant le mi-temps du moustique aseptique pour l’essai d’unité de formation de colonie avant les extrémistes suivants. Réintroduisez ensuite des espèces bactériennes spécifiques qui étaient auparavant isolées de l’intestin des moustiques par l’intermédiaire d’un test d’alimentation orale.
L’effet des bactéries sur la physiologie de l’hôte pourrait être évalué en comparant les moustiques non traités, les moustiques traités aux antibiotiques et les moustiques réintroduits de retenue spécifique. Dissection midgut et isolement des bactéries cultivables. Pour commencer, recueillir les moustiques en cage avec un aspirateur et cellulaire les moustiques dans la boîte de collecte.
Anesthésier les moustiques en soumettant à une température de 4 degrés pendant trois à cinq minutes. Gardez les moustiques anesthésiés en les plaçant dans une boîte de Pétri glacée. Désinfecter le banc, disséquer le microscope et les forceps en pulvérisant 75 % d’éthanol pour éviter la contamination par les bactéries de l’environnement.
La surface stérilise le moustique en l’enseilant et en le secouant à 75 % d’éthanol pendant trois minutes et rincez deux fois avec le tampon PBS. Coupez le moustique séparément sur une lame de verre stérile contenant votre goutte de PBS. Retirez soigneusement les jambes, les ailes et la tête du moustique à l’aide de forceps.
Pincer la poitrine du moustique et la dernière section de l’abdomen a été forceps et se détacher pour isoler le tube digestif. Utilisez des forceps pour enlever la culture et le tube malpighien du tube digestif. La culture est positionnée au pnterior de midgut et gonfle après avoir ingéré de l’eau sucrée.
Les tubes malpighiens sont un groupe de tubes excréteurs minces à la jonction du midgut et du hindgut. Placez le maquillage disséqué dans le tube EP avec 200 microlitres stériles tampon PBS et le moudre avec le pasteur de broyage stérile dans le banc propre. Céréales pour charger l’homogénéité à trois illusions de tempo à 50 microlitres de chaque illusion à la plaque d’agar LB et assiette désespérée.
Incuber la plaque à 37 degrés pendant un à deux jours jusqu’à ce qu’une seule colonies soit possible. Choisissez des colonies simples dans une fiole conique de 150 millilitres contenant un support de 50 millilitres lb moyen. secouer les bactéries à 37 degrés pendant la nuit.
Identification des espèces. Extraire l’ADN TOTO par kit de construction d’ADN génomique bactérien et amplifier 16 SRDNA par PCR. Récupération et purification des fragments d’ADN des produits PCR par l’électrophoresis gel Ambrose et le kit de récupération conduit.
Séquençage de l’ADN effectué sur les fragments d’ADN purifiés pour avoir une chaîne de bactéries atteint séquences. Exécuter la recherche de souffle à une requête de la séquence de 16 gènes SRNA d’identifier les bactéries contre les bactéries et l’archée et la base de données. L’identification au niveau de l’espèce a été définie comme supérieure ou égale à 99%16 similitude de séquence SRDNA avec l’entrée bancaire d’équipe la plus proche.
L’isolat lui a été attribué au genre correspondant quand est 16 séquence de SRDNA, la similitude était inférieure à 99% et supérieure ou égale au traitement antibiotique de 95% et à la réintroduction de bactérie. peser la quantité requise de pénicilline saccharose et de streptomycine pour nous préparer 10% solution saccharose, y compris essayer 20 unités de pénicilline et les 20 microgrammes de streptomicine par millilitre. Infiltrer les boules de coton dans la solution de saccharose contenant des antibiotiques et placez-les sur le dessus de la tasse en papier contenant du moustique.
Couvrir la boule de coton d’une boîte de Pétri de 10 centimètres pour éviter qu’un front de mer ne s’évapore. Remplacer les boules de coton deux fois par jour et nourrir le moustique pendant trois jours consécutifs. Les moustiques sont divisés en deux groupes.
Le premier groupe a été placé dans une tasse de moustique sans aucun traitement, n’importe quel docteur de boules de coton avec la croix de 10%So a été donné quotidiennement. Le deuxième groupe a été traité avec des antibiotiques et servir pendant trois jours. Dans chaque groupe, les moustiques Sergei ont été disséqués.
Le Mika a été extrait pour l’extraction totale d’ADN et le QPCR a été exécuté utilisant des amorces universelles de bactéries, figure un montre l’expression de 16 ARN dans le groupe témoin et le groupe de traitement antibiotique. Les résultats montrent que le coût ou la réalisation de la pénicilline et de la streptomycine a été un succès. préparer une solution bactérienne, mesure une solution bactérienne dans le virus avec un spectrophotomètre, ajouter une suspension de bactéries OT dans le tube EP.
Centrifugeuse la suspension à 5000 RCA pendant cinq minutes à quatre degrés Jeter le supernatant, laver la palette bactéries tente avec tampon stérile PBS. Suspendre à nouveau la palette bactérienne avec 200 microlitres stériles tampon PBS Ajouter 600 microlitres, 10% solution saccharose, 200 microlitres ATP et 200 microlitres suspension bactérienne dans un nouveau tube AP et bien mélanger. Alternativement, les bactéries peuvent être re-suspendues dans la chaleur pour activer votre sang.
Préparation du chauffage du sang activé. caillot de sang frais avec tube anticoagulant, prendre deux à trois millilitres de sang frais. centrifugeuse à 1000 pendant 10 minutes à quatre degrés pour séparer le plasma et les cellules sanguines.
Recueillir le plasma dans un nouveau tube EP et activer ici activé à un degré 56 pendant une heure. Wash Blast maison à travers votre temps avec tampon PBS stérile. Rincer la maison de dynamitage suspendue avec le plasma activé par chauffage.
Assembler la membrane et le système d’alimentation. Tirez la maladie du film au maximum. fixer avec l’anneau en plastique et parafilm lieu de travail pour éviter la fuite lentement ajouter la solution bactérienne préparée à l’unité d’alimentation, au portefeuille maximum.
Pour éviter la bulle est tombé d’une direction et sceller l’unité d’alimentation. Connectez l’alimentation électrique. Attendez que la température atteigne 37 degrés Installé l’unité d’alimentation avec solution bactérienne sur la mangeoire.
Avant d’alimenter les bactéries moustiques devraient être arrêtés pendant 24 heures pour métaboliser les antibiotiques. Pour l’unité d’alimentation sur la tasse en papier avec des moustiques, puis laisser l’alimentation pendant 90 minutes. Les moustiques pleinement encouragés pourraient être cueillis pour d’autres études.
Résultats représentatifs. La figure deux nous montre l’accolade moyenne par moustique. Après l’alimentation de parcelle des antibiotiques traités les moustiques nous voyons le méningosepticum.
La figure trois montre l’expression d’une variante des gènes liés au développement 24 heures après la farine de sang contenant le méningosepticum C. Les résultats montrent qu’il n’y a pas de changement significatif dans la production d’œufs du groupe témoin et du groupe de décoloration. Merci pour votre intérêt pour les bactéries ou un essai d’alimentation avec des moustiques traités aux antibiotiques.
