Mosquito midgut alberga una compleja comunidad de microbios que afectan el metabolismo del huésped, la reproducción, la aptitud física y la competencia veterinaria. Con cada microbio intestinal es un efecto diferente. Este video introduce el procedimiento para estudiar el papel respectivo de cada cepa bacteriana o fisiología del huésped.
Para adquirir un cultivo de colonias bacterianas intestinales, disecciona el dorso en condiciones estériles. Aterrizar el punto medio diseccionado, serotologinar, y extenderse sobre la placa de agar. Escoja colonias individuales de la placa e identifique las especies de bacterias a través de su secuencia de 16 genes SRNA.
Alimentar a los mosquitos con COD Emboss que contiene antibióticos durante tres días consecutivos para eliminar la microbiota intestinal. La eficacia del tratamiento con antibióticos puede confirmarse diseccionando el encuse de mosquito aséptico para el ensayo de la unidad formadora de colonias antes de los extremistas subsiguientes. Luego reintroducir especies de bacterias específicas que previamente se aislaron del intestino del mosquito a través del ensayo de alimentación oral.
El efecto de las bacterias en la fisiología del huésped podría evaluarse comparando los mosquitos no tratados, los mosquitos tratados con antibióticos y la restricción específica de los mosquitos. Disección de la parte media y el aislamiento de bacterias cultivables. Para empezar, recoge los mosquitos en jaula con un aspirador y celda de los mosquitos en la caja de recolección.
Anestesiar a los mosquitos sometiendo a una temperatura de 4 grados durante tres a cinco minutos. Mantenga los mosquitos anestesiados colocándolos en un plato de Petri helado. Desinfecte el banco, el microscopio de disección y los fórceps pulverizando un 75% de etanol para evitar la contaminación por bacterias del medio ambiente.
La superficie esteriliza al mosquito enroscándolo y sacudiéndolo en 75%etanol durante tres minutos y enjuáguelo dos veces con el tampón PBS. Bisect el mosquito por separado en un portaobjetos de vidrio estéril que contenga su gota de PBS. Retire con cuidado las patas, las alas y la cabeza del mosquito con fórceps.
Sujeta el pecho del mosquito y la última sección del abdomen fue fórceps y desmonta para aislar el tracto digestivo. Use fórceps para extraer el cultivo y el tubo malpighiano del tracto digestivo. El cultivo se coloca en el pnterior de la parte media y protuberancias después de ingerir agua azucarada.
Los tubos malpighianos son un grupo de tubos excretores delgados en la unión de la parte media y la parte posterior. Coloque el maquillaje diseccionado en el tubo EP con 200 microlitros estériles PBS buffer y molerlo con el pastor de molienda estéril en el banco limpio. Cereal para cargar el homogeneización a tres delirios de tempo a 50 microlitros de cada delirio a la placa de agar LB y placa desesperada.
Incubar la placa como 37 grados durante uno o dos días hasta que las colonias individuales sean factibles. Escoja colonias individuales en un matraz cónico de 150 mililitros que contenga un medio de sujetadores de 50 mililitros lb. agitar las bacterias a 37 grados durante la noche.
Identificación de especies. Extraiga ADN TOTO mediante un kit de construcción de ADN genómico bacteriano y amplifique 16 SRDNA por PCR. Recuperación y purificación de fragmentos de ADN de productos de PCR por electroforesis de gel de Ambrose y el kit de recuperación de impulsión.
Se realizó la secuenciación de ADN en los fragmentos de ADN purificado para tener una secuencia de cadena de bacterias alcanzada. Realizar la búsqueda de granallado a una consulta de la secuencia de 16 genes SRNA de identificar las bacterias contra las bacterias y la arquea y la base de datos. La identificación al nivel de la especie se definió como mayor o igual que 99%16 SRDNA similar a la entrada de banco del equipo más cercana.
El aislado se asignó al género correspondiente, cuando es 16 secuencia SRDNA, la similitud era menor que 99% y mayor o igual a 95%tratamiento antibiótico y re-introducción de bacterias. pesar la cantidad necesaria de penicilina de sacarosa y estreptomicina para prepararnos 10%solución de sacarosa, incluyendo probar 20 unidades de penicilina y los 20 microgramos de estreptomicina por mililitro. Infíltrate en las bolas de algodón en la solución de sacarosa que contiene antibióticos y colóquela sobre la parte superior de la taza de papel que contiene el mosquito.
Cubra la bola de algodón con un plato Petri de 10 centímetros para evitar que un paseo marítimo se evapore. Sustituya las bolas de algodón dos veces al día y alimente al mosquito durante tres días consecutivos. Los mosquitos se dividen en dos grupos.
El primer grupo se colocó en una taza de mosquito sin ningún tratamiento, cualquier médico de bolas de algodón con 10%Así que la cruz se dio diariamente. El segundo grupo fue tratado con antibióticos y sirvió durante tres días. En cada grupo, los mosquitos Sergei fueron diseccionados.
El Mika fue extraído para la extracción total de ADN y el QPCR se realizó utilizando imprimaciones de bacterias universales, figura uno muestra la expresión de 16 ARNs en el grupo de control y grupo de tratamiento antibiótico. Los resultados muestran que el costo o realización de penicilina y estreptomicina fue exitoso. preparar la solución bacteriana, mide una solución bacteriana en el virus con un espectrofotómetro, añadir una suspensión de bacterias OT en el tubo EP.
Centrifugar la suspensión a 5.000 RCA durante cinco minutos a cuatro grados Deseche el sobrenadante, lave el palé de bacterias intenta con tampón PBS estéril. Re-suspender el palet bacteriano con 200 microlitros estériles PBS buffer Añadir 600 microlitros, 10% solución de sacarosa, 200 microlitros ATP y 200 microlitros suspensión bacteriana en un nuevo tubo AP y mezclar bien. Alternativamente, las bacterias pueden ser re-suspendidas en calor en activar la sangre.
Preparación de la sangre activada por calentamiento. clot sangre fresca con tubo anticoagulante, tomar de dos a tres mililitros de sangre fresca. centrífuga a 1000 durante 10 minutos a cuatro grados para separar el plasma y las células sanguíneas.
Recoger el plasma en un nuevo tubo EP y aquí activar activado a 56 grados durante una hora. Lave Blast house a través de sus tiempos con tampón PBS estéril. Enjuague la casa de la explosión suspendida con el plasma activado por calefacción.
Montar membrana y sistema de alimentación. Tire de la enfermedad de la película al máximo. arreglar con el anillo de plástico y la parafilmación del lugar de trabajo para evitar que las fugas agreguen lentamente la solución bacteriana preparada a la unidad alimentadora, al máximo monedero.
Para evitar que la burbuja cayera desde una dirección y sellar la unidad alimentadora. Conecte la fuente de alimentación. Espere hasta que la temperatura alcance los 37 grados Instalado la unidad alimentador con solución bacteriana en el alimentador.
Antes de alimentar a los mosquitos bacterias se deben detener durante 24 horas para metabolizar los antibióticos. Para la unidad de alimentación en la taza de papel con mosquitos, luego deje alimentar durante 90 minutos. Los mosquitos totalmente alentados podrían ser recogidos para más estudios.
Resultados representativos. La figura dos nos muestra el galardón promedio por mosquito. Después de la alimentación de la trama de antibióticos tratados los mosquitos vemos meningosepticum.
La figura tres muestra la expresión de una variante de genes relacionados con el desarrollo 24 horas después de la comida de sangre que contiene el meningosepticum C. Los resultados muestran que no hay ningún cambio significativo en la producción de huevos del grupo de control y el grupo de desvanecimiento. Gracias por su interés en las bacterias o un ensayo de alimentación con mosquitos tratados con antibióticos.
