Hem röntgen hem de nötron kristalografisi için büyük ve kaliteli kristaller elde etmek için farklı kristalleşme yaklaşımları vardır. Bu yaklaşımlardan biri diyaliz yöntemini kullanmaktır. Bu teknikte, protein çözeltisi çökeltici bir çözeltiden yarı geçirgen bir membran ile ayrılır.
Çökelti molekülleri zar boyunca protein odasına yayılır. Spontan bir çekirdeklenme için doğru aşırı doyma sağlandığında, ilk çekirdek görünecektir. Burada, OptiCrys tarafından laboratuvarımızda geliştirilen ve sıcaklık kontrollü diyaliz kristalizasyonu kullanan tam otomatik bir cihaz ve kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak doğal makromoleküler kristalografi için büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için mikro diyaliz düğmelerimiz tarafından kullanılabilecek bir protokol göstereceğiz.
Belirli bir mikrolitre hacimli pipet ile bir mikro diyaliz düğmesi için diyaliz odasına 35 mikrolitre lysozyme çözeltisi. Bu ekstra hacim diyaliz odasının üstünde hafif bir kubbe şekli oluşturur ve hava kabarcığı oluşumunu önler. Bir aplikatör alın ve elastik veya halkayı ekstremitesine yerleştirin.
Zarı haznenin üzerine yerleştirin ve elastik veya halkayı aplikatörden diyaliz düğmesinin oluğuna aktararak sabitlayın. Düğmeyi kristalizasyon çözeltisini içeren kuyuya aktarın. Kuyuyu bir cam kapak fişi veya bir bant parçası ile örtün.
Numuneyi titreşimsiz bir termal regülatör inkübatöründe 293 Kelvin'de tutun. Diyaliz kristalizasyonunun kristal büyümesi açısından avantajlar sunduğunu bilerek, OptiCrys adı verilen kristalizasyon tezgahı, laboratuvarımızda biyomoleküler kristalizasyon deneyinin sıcaklık ve kimyasal bileşiminin tam otomatik bir birleşik kontrolünü sunmak için tasarlanmış ve geliştirilmiştir. OptiCrys tarafından kristal büyümesinin optimizasyonu, sıcaklık çökeltisi konsantrasyon faz diyagramlarına dayanmaktadır.
Çekirdeklenme, metastable bölgesinin ve kristal büyümesinin çevresindeki çekirdeklenme bölgesinde gerçekleşir, daha sonra protein konsantrasyonu çözelti ve kristaller arasındaki termodinamik dengeyi temsil eden çözünürlük eğrisine ulaşana kadar faz diyagramı sonrası metastable bölgede gerçekleşir. Proteinin doğrudan çözünürlükte olması durumunda sıcaklığı düşürerek veya tuzlama durumunda çökelti konsantrasyonunu artırarak kristalleşme çözeltisi metastable bölgede kalır ve çekirdeklenme meydana gelmez. Kristaller, ikinci kristal çözelti dengesi elde edilene kadar büyür ve bundan sonra kristallerin boyutunda daha fazla artış gözlenmez.
Sıcaklığı azaltmak veya çökelti konsantrasyonu arttırılması, kristaller istenen boyuta ulaşana kadar birkaç kez tekrarlanır. Protein çözeltisini sıcaklık kontrollü akan kurulumun diyaliz odasına ekleyin, üst hazneyi diyaliz zarı ile örtün ve zarı elastik veya halka ile sabitleyin. Üst bölmeyi çevirin ve diyaliz odasının üstüne koyun.
İki parça arasında sıkışan tüm havayı çıkarmak için hafifçe ve yavaşça bastırın, rezervuarı üst bölmenin üzerine hafifçe vidalayarak yerine sabitleyin. Kristalizasyon çözeltisini rezervuar odasına ekleyin ve hava geçirmez kapakla örtün. Bu montajı aktarın ve kristalizasyon bankı OptiCrys'in meme desteğine yerleştirin Kristalleşme Tezgahı OptiCrys'in bir gözetim yazılımıdır.
Dört farklı grafik arayüz veya görünüm içerir. Giriş görünümü, diğer görünümlere gitmek için düğmeler içerir. Kurulum arabiriminin amacı, test görünümünde otomatik olarak çalıştırılabilen bir deneme senaryosu tanımlamaktır.
Son görünüm bakım görünümüdür. Bir denemeyi yeniden başlatmak için, kristalizasyon deneylerini sorunsuz bir şekilde çalıştırmak için gerekli tüm parametrelerin bulunduğu bakım görünümünün açık olması gerekir. Işık bölümünden parlaklığı artırın, ışık sıfırdan artabilir, ışık yok maksimum 100 parlaklığa.
Sıcaklığı kontrol etmek ve izlemek için sıcaklık regülatörü bölümü kullanılır. Açmak için düğmeye tıklayın. Ayarlanan nokta bölümündeki sıcaklığı ayarlayın ve enter tuşuna basın.
Bu düğmenin altında iki grafik vardır. Kırmızı olan finali, sipariş sıcaklığını ve sarı grafik geçerli sıcaklığı gösterir. Bir stok çözeltisinin karıştırılması, kristalizasyon çözeltisinin rezervuar odasına enjeksiyonu Palm bölümü ile kontrol edilir.
stok çözeltisinin konsantrasyonunu ilk aşamada ekleyin. Ardından her yeni torlayıcı çözeltisinin son konsantrasyonu bulun ve bunları son konsantrasyon bölümüne ekleyin. Hesapla düğmesine bastıktan sonra, stok çözeltisinin hacminin hesaplanacağını ve her konsantrasyon panelinin önündeki hacim panelini ekleyeceğini öğrenin.
Başlatma hazırlığı düğmesine basın ve yeni premier çözüm hazır olana kadar bekleyin. Kristalizasyon çözümünü değiştirmek için Çözüm Girişi düğmesine tıklayın. İşlemi durdurmak için Dağıtımı Durdur düğmesine basın.
Mikroskop bölümünün sağ tarafında, her kristal büyüme deneyinden önemli bilgileri kaydetmek için birkaç panel vardır. Bu bölüme ilgili proteinlerin adını, moleküler ağırlığını ve kristalizasyon durumunu ekleyin. Denemeleriniz için klasör adına yazarak bir ad tanımlayın.
Nb görüntüleri bölümünden, deneme sırasında alınması gereken görüntü sayısını seçin. Görüntülerin numarasını ekleyin ve sağdaki panelden zamanlayıcı ölçeğini seçin. Klasörü açmak için klasör düğmesini tıklatın.
Bu klasörde, daha önce denemeniz için tanımladığınız tüm bilgileri içeren bir metin dosyası vardır. Başka bir işlem için hazır görüntüler de bu klasöre kaydedilir. Mikroskobu yakınlaştırın, otomatik olarak da değiştirilebilir.
Büyütmeyi artırmak veya azaltmak için mikroskop bölümünün üstündeki artı ve eksi düğmesini kullanarak yakınlaştırmanızı değiştirir. Kristal boyutunu ölçmenin üç farklı yolu vardır. Uzunluğu veya genişliği ölçmek için genişlik vektörü kullanın.
Kristal şekline bağlı olarak mikroskop bölümünün sol kısmından belirli aletler seçilebilir. Dikdörtgen veya çokgen gibi. Değerler ölçü bölümünde görünecektir.
İlk deney setinde mikrodiyaliz düğmeleri farklı tuz konsantrasyonlarına sahip kristalizasyon çözeltilerine daldırıldı. Bu basit kristalleşme ızgarası deneyinde, tek değişken çökeltici konsantrasyondur. sıcaklık sabit tutulurken.
Tuz konsantrasyonundaki hafif değişimler, tuz konsantrasyonunu 0,7'den 1,2 molar aşırı doyma artışına yükselterek kristalizasyon faz diyagramını araştırmaya izin verir ve çekirdeklenme bölgesindeki çözelti metastable bölgeden uzaklaşır. Sonuç olarak, kristallerin sayısının artması ve boyutlarının azalmasıyla kristallerin boyut ve sayısında bir değişim gözlenir. Verilen deneysel durum altında OptiCrys ile yapılan ilk deneyde, diyaliz odasındaki denge bir kez ulaştığında, kristalizasyon çözeltisi, kristalizasyon faz diyagramının metastable bölgesinin çevresindeki çekirdeklenme bölgesindedir.
Sonuç olarak, deneyin ilk aşamasında sadece birkaç çekirdek üretilir. Kristallerin büyümesini metastable bölgede tutmak ve kristal büyüme sürecini kontrol etmek için sıcaklık farklı zaman aralıklarında değiştirildi. Kristal çözelti dengesi her tamamlandığında, sıcaklık çeşitliydi.
Bu nedenle sıcaklık, metastable bölgesinde seçilen kristalin büyümesini korumak için 291 Kelvin, 288 Kelvin ve son olarak 275 Kelvin'e düştü. Bu deneyin sonucu, doğal makromoleküler kristalografi için gerekli hacme sahip tek bir büyük kristaldir. Sonraki iki deney, çekirdeklenme, kristal büyümesi, çözülme ve yeniden büyüme için sıcaklık kontrollü diyaliz deneylerinin geri döndürülebilirliğini göstermektedir.
OptiCrys ile yapılan ikinci deneyde, kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimi deney boyunca sabit tutuldu ve sıcaklık değişti. İlk sıcaklık 291 Kelvin olarak belirlendi. Yüksek aşırı doyma nedeniyle, kristalleşme odasında çok sayıda küçük kristal ortaya çıktı.
Doğrudan protein çözünürlüğü kavramına uygun olarak, sıcaklığı kademeli olarak 313 Kelvin'e çıkararak tüm kristaller çözülecekti. Son olarak, sıcaklığı 295 Kelvin'e düşürerek, ikinci çekirdekleme metastable bölgenin yakınında başlatıldı ve çekirdeklenme sürecini kontrol etmesine izin verdi ve daha az sayıda çekirdek oluşmasına neden oldu. Daha fazla kristal büyümesi, daha büyük kristallerin tekdüze popülasyonunun üretilmesine izin verildi.
Bu deneyde, kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimini sabit sıcaklıkta değiştirmek, daha büyük kristallerden oluşan tekdüze bir popülasyon elde edilmesine yol açar. Kristalleşme durumu önceki deneye benzerdi. Kristallerin çözülmesi, NaCl konsantrasyonu kademeli olarak 0,9 azı dişinden sıfıra indirilerek elde edildi.
Tuz konsantrasyonunun azaltılması, çözeltiyi faz diyagramının az doymamış bölgesinde tutar ve bu da kristallerin çözünmesine yol açar. Daha sonra daha önce olduğundan daha düşük iyonik mukavemete sahip yeni kristalizasyon çözeltisi rezervuar odasına enjekte edildi. Bu çökelti konsantrasyonunda daha az sayıda kristal ortaya çıkar ve kristaller öncekinden daha büyük bir hacme ulaşır.
Burada, laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir alet kullanarak doğal makromoleküler kristalografi için büyük ve yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için numune hazırlama ve kontrol yazılımını ayarlamayı açıklayan ayrıntılı bir protokol sağladık. Bu adım adım prosedür, çekirdeklenme ve kristal büyümesini ayırmak için kristalizasyon faz diyagramının bilgisinden yararlanarak tasarlanmıştır. Ayrıca, OptiCrys mevcut olmadığında alternatif olarak makrositoz düğmeleri kullanılarak mikrositoz desenli kristal yetiştirmek için bir protokol de sunulmaktadır.
OptiCrys için bahsettiğim stratejilere ek olarak kristalizasyon çözeltisinin ve sıcaklığının kimyasal bileşimini değiştirmek ve görüntü almak manuel olarak yapılmalıdır. Sıcaklığı sabit tutmak için inkübatör için termal düzenlenmiş titreşimin kullanılması gerekir, bu da gösterilen metodolojide kritik bir adımdır.
