Bu eser Orman Rohwer verilen Ulusal Sağlık Enstitüsü (1 R01 GM095384-01) tarafından desteklenmiştir. Biz Ribo-Zero Epidemiyoloji kitleri erken erişim sağlamak için Epicentre, bir Illumina şirket teşekkür ederim. Biz Ultrasantrifügasyon tüp tutucu tasarımı ve üretimi için Mark Hatay teşekkür ederiz. Biz filme sürecine yardımcı kritik okuma ve yazının tartışmalar için Andreas Haas ve Benjamin Knowles teşekkür ve Lauren Paul.

NOT: ndüklenmifl balgam Kaliforniya, San Diego Üniversitesi araştırma koordinatörü (UCSD&#39;de tarafından, Kaliforniya Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi (HRPP 081.500) ve San Diego Eyalet Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK 2121 SDSU #) uyarınca toplandı ) yetişkin CF kliniği. 1. Örnek Toplama ve Tedavi öncesi (Koleksiyonu sonra 30 Min içinde Öncesi tedavi Örnekleri) <ol><li> Önceki örnek için toplama, etiket dört 15 ml tüpler (i), viral metagenome, (ii) mikrobiyal metagenome, (iii) metatranscriptome, ve (iv) ilave balgam. Her bir numune için tekrarlayın. Guanidin izotiyosiyanat RNA dayalı liziz tamponu (GITC-lizis tamponu) 6 ml, ardından &quot;Metatranscriptome&quot; etiketli tüp içine 0,1 mm silis boncuklar 2 ml ilave edilir. </li><li> Örnek toplama sırasında, ağız mikroplar tarafından kirlenmesini en aza indirmek için, bir ağız çalkalama suyu gibi steril tuzlu su çözeltisi (60 mi) kullanılır. Sonra 30 dakikalık bir süre boyunca balgam örnekleri toplamakBir püskürtücü ile% 7 hipertonik tuz, 4 ml inhalasyonu. İşlem, örnekler hemen aşağıda tarif edildiği gibi. </li><li> 8 ml bir toplam hacme örnek seyreltin. <ol><li> Öncesi ve numune toplama sonra boş balgam fincan tartılarak örnek hacmi tahmin. </li><li> Örneğin hacmi en az 8 mi ise, en az 8 ml toplam numune hacmi oluşturmak için 0.02 um filtreden 1x PBS uygun miktarda. </li><li> Hiçbir görünür kümeleri balgam içinde kalır kadar hemen 3 ml şırınga ile örnek homojenize </li><li> Balgam 2 ml hazırlamak ve 1.4 adıma hemen geçin, aynı şırınga kullanarak. </li></ol></li><li> Balgam Numune Toplam RNA koruma <ol><li> Silis boncuklar ve GITC parçalama tampon içeren &quot;metatranscriptome&quot; tüp içine adım 1.3.4 2 mi balgam numunesi enjekte edilir. </li><li> Kapağı kapatın ve sızıntıyı önlemek için Parafilm ile güvenli tüp mühür. </li><li> 10 mi için orta hızda hemen balgam homojenizen. Mevcut vortexer bağlı, yatay tüp yerleştirmek ve gerekirse bant ile sabitleyin. </li><li> Gerekirse laboratuvara buz kutusu ve taşıma 4 ° C&#39;de ya da tüp tutun. </li></ol></li><li> Aynı şırınga, kısım &quot;Viral metagenome&quot; ve &quot;mikrobiyal metagenome&quot; ve &quot;Çok balgam&quot; etiketli bir tüpe balgam fincan kalan balgam transferi etiketlenmiş tüpler içine balgam her biri 2 ml kullanılması. </li><li> Gerekirse laboratuara 4 ° C ya da buz kutusu ve nakliye de tüm tüpler saklayın. </li></ol> 2. Yaratma Viral metagenome <ol><li> Tamponlar ve Çözümleri hazırlanması <ol><li> 4 ° C&#39;de önceden ve depoda 50 mM ditiotreitol (DTT) hazırlayın. Bu durum 2 hafta boyunca stabildir. </li><li> Tuzlu Magnezyum (SM), tampon (250 mi) Hazırlama 1 M NaCI, 10 mM MgSO 4, 50 mM Tris-HCI; pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. Oda sıcaklığında sterilize Filtresi (0.02 mikron gözenek boyutu) ve mağaza. </li&gt; <li> Ben Dornaz ünitesi / mg kuru ağırlık olarak tanımlanan aktivitesine göre liyofilize sığır pankreas Dnase gelen (moleküler sınıf su içinde) Ben 100 U / ul enzim DNase hazırlayın. </li><li> Bir tampon 10x DNase (50 mi) Hazırlama: 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; pH 6,5&#39;e ayarlanır. Oda sıcaklığında sterilize Filtresi (0.02 mikron gözenek boyutu) ve mağaza. </li><li> % 4 paraformaldehid hazırlayın. </li><li> 200x TE Tamponu hazırlayın: 2 M Tris-HCl (pH 8.5), 0.2 M EDTA. Oda sıcaklığında sterilize Filtresi (0.02 mikron gözenek boyutu) ve mağaza. </li><li> Moleküler dereceli su ile,% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS), 10 ml hazırlayın. </li><li> Moleküler sınıf su kullanarak 50 ml CTAB / NaCl (% 10 CTAB. 700 mM NaCl) hazırlayın. CTAB gecede çözülür. Çökeltiler devam ederse, 65 ° C&#39;de çözüm ısınır. Çözelti, oda sıcaklığında oldukça viskoz. NOT: 0.02 um filtre kullanılarak tampon süzme çözeltisi içinde virüs benzeri partiküllerin ayrılmasını sağlar, ancakücretsiz nükleik asit kirlenme. </li></ol></li><li> Örnek Ön arıtma <ol><li> Taze 6.5 mM ditiyotreitol (DTT), uygun miktarda hazırlayın. </li><li> 6 ml &#39;lik bir toplam hacim oluşturmak için 0.02 um filtreden SM tamponu ilave edilerek Homojenat seyreltin. </li><li> Örnek 6.5 mM ditiyotreitol (DTT) eşit bir hacmi (6 mi) ilave mukus çözünmelerine yardımcı olmak için, girdap kuvvetli bir şekilde karıştırın ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübasyona. </li><li> Vorteks 10 ° C&#39;de kuvvetli bir şekilde muamele edilmiş numune ve sıkma, 15-20 dakika boyunca 3,056 x g. </li><li> Yeni 15 ml tüp içine süpernatant toplayın. </li><li> Adımı yineleyin 2.2.3 ve sonraki numune için 2.2.5. </li><li> Transferi ve yeni bir 15 ml&#39;lik bir tüp içine, bir şırınga üzerine monte edilmiş bir 0.45 um filtre ile süpernatant filtre. NOT: Filtre takunya, şırınga numune almak ve filtrasyon adımı atlarsanız. </li><li> (Bkz, 0.45 um filtreden numune 100 ul alt-numûnesinin al kloroform ve DNase I tedavi yerine section 2.3.12-2.3.15) ve) Epifloresans mikroskobu (Şekil 2A için örnek düzeltmek için% 4 paraformaldehid eşit hacmi ekleyin. </li><li> Bir &quot;catch-all&quot; viral parçacıkların zenginleştirme yaklaşım için (Tartışma), sezyum klorür degrade Ultrasantrifügasyon dayalı viral partiküller seçimi ihmal 2.3.12 adıma gidin. Bununla birlikte, bu kloroform dirençli bakteriyel kontaminasyon ve virüs lizatı konakçı-DNA&#39;nın daha yüksek bir miktarda neden olabilir. </li></ol></li><li> Viral-benzeri partiküller (VLP&#39;ler) zenginleştirilmesi ve saflaştırma <ol><li> İstenen yoğunluğa filtreden SM tamponu ile CsCl uygun bir miktarının çözülmesiyle tek sezyum klorür (CsCl) çözelti hazırlayın (1.7 ug / ml 1.5 ug / ml, 1.35 ug / ml ve 1.2 ug / ml). Kullanımdan önce bir 0.02 mikron filtre içinden her solüsyonu filtre. </li><li> Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, bir CsCl gradyanı ayarlayın. </li><li> Yük 1.7, 1 ml / ml her bir tüpe, yük 1.5, 1 ml içinde ug / ml her bir tüpe, yükü 1 mi 1.35 g içineHer tüpe / ml (isteğe bağlı), her bir tüpe, yük 1.2 ug / ml ve son olarak söz konusu boru içine 6-8 ml lik bir numuneyi yükleyin. Marka tek tek tabakaların her fraksiyon konumunu göstermek için kullanılır. </li><li> 1 mg dahilinde tüplerin her karşıt çifti dengeleyin. </li><li> Dikkatle sıkma kova içine her tüp yükleyin. Onlar boş olsa bile, tüm kova Spin. Rotor üzerine sıkma kova yükleyin. </li><li> 2 saat süre ile 4 ° C&#39;de 82844 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj sonrasında, dikkatli yoğunluk gradyanları aksatmadan tutucu tüpleri çıkarın. </li><li> 18 G iğne ile 3 ml şırınga kullanarak, sadece 1,5 gr / ml yoğunlukta tabakasının altında (Şekil 2, kırmızı ok) tüp delmek ve enjektöre 1.5 ~ ml çekin. </li><li> Yavaş yavaş iğne kaldırma ve tüp içinde kalan fraksiyon ponksiyon yoluyla yeni bir 15 ml tüp içine damla izin vererek üst kısmını toplayın. &quot;Üst kısım atık&quot; olarak etiketleyin. </li><li> 1.5 ug / ml fractio toplamakn iki yeni mikrofuj tüpleri içine içeriğini püskürtülmesi yoluyla şırınga (VLP&#39;lerini içeren). </li><li> Tüm numuneler için yineleyin 2.3.8-2.3.10. </li><li> Viral konsantre içine kloroform içinde 0.2 hacim ekleme şiddetle çalkalanır, 5 dakika maksimum hızda, 10 dakika, bir dönüş için oda sıcaklığında inkübe edilir, ve sulu faz toplanır. </li><li> Kloroform ile muamele edilmiş, viral konsantre içine 10x DNaz tampon ve DNase I (nihai konsantrasyon = 2.5 U / ul) ekleyin ve 1.5-2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 15 dakika boyunca 65 ° C &#39;de, DNase etkinliğini aktif hale getirmesi. </li><li> Yeni bir tüp içine KLOROFORM ve DNase I ile tedavi edilen virüs fraksiyonunun 15 ul çıkarın ve epifloresans mikroskopi için örnek düzeltmek için 15 ul% 4 paraformaldehid ilave edin. </li></ol></li><li> DNA Ekstraksiyon <ol><li> Bir temizlenmeli ve otoklava 50 ml Oak Ridge yüksek hızlı santrifüj tüpüne her örnekten Havuz viral konsantreler. </li><li> S ml başına, 10 ul 0.5 M EDTA 0.1 hacim 200x TE tamponu: Aşağıdaki eklebol, formamid 1 hacim ve 10 ul glikojen. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yeni birimler kullanılarak, oda sıcaklığında,% 100 etanol içinde 2 hacim ekleyin. İyice karıştırın ve en azından 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> SS-34 rotor kullanılarak 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 17.226 x g&#39;de tüpün döndürülmesiyle Pelet bir DNA. </li><li> Serolojik pipet kullanarak dikkatlice süpernatant atın. Buz soğukluğundaki% 70 etanol ile iki kez pelet yıkayın. </li><li> Mümkün olduğu kadar çok sıvıyı çıkarın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya pelet sağlar. </li><li> 1x TE tamponu (pH 8.0) içinde 567 ul DNA pelletini. Not: Oda sıcaklığında tam olarak yeniden süspanse için en az 15 dakika bekleyin. Daha sonra işlenene kadar 4 ° C&#39;de gece boyunca yeniden süspanse edildi DNA saklayın. </li><li> Yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpü içine yeniden süspanse DNA çözeltisi, tüm 567 ul aktarın. 20 _ (önceden ısıtılmış,% 10 SDS ve 30 ul proteinaz K 3 ul ekle6 g / mi), iyice karıştırın ve 56 ° C&#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. 65 ° C sıcaklıkta, CTAB / NaCI öncesi sıcak. </li><li> 5 M NaCI ve 100 ul ilave edin ve iyice karıştırın. Önceden ısıtılmış CTAB / NaCI çözeltisi, girdap 80 ul ekleyin ve 65 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 16.100 xg&#39;de kloroform, karıştırmak için girdap ve spin eşit hacmi ekleyin. </li><li> Yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe süpernatant aktarın. 5 dakika boyunca 16.100 x g&#39;de, fenol / kloroform, karıştırmak için girdap ve spin eşit hacim. </li><li> Yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe süpernatant aktarın. 5 dakika boyunca 16.100 x g&#39;de kloroform, karıştırmak için girdap ve spin eşit hacim. </li><li> Yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe süpernatant aktarın. Süpernatan fraksiyonu izopropanol eşit miktarda ekleme karıştırın ve en azından 30 dakika boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 16.100 x g&#39;de DNA, santrifüj pelet. Dikkatle süpernatant pipet ve buz soğukluğundaki% 70 etanol ile iki kere yıkayın pelet. </li&gt; <li> Kısa bir spini gerçekleştirin ve tüp kalan etanol kaldırmak. Hava, 15 dakika boyunca pelet kurutulur. </li><li> Elüsyon tamponu (5 mM Tris, pH 8.5), 50 ul DNA pelletini. Topak, oda sıcaklığında en az 5 dakika süre ile rehidrate izin verin. </li><li> Yüksek hassasiyetli floresan bazlı analiz kullamlarak DNA miktarı belirlenir. </li></ol></li><li> Phi29 Polymerase kullanarak büyütme (İsteğe bağlı) <ol><li> 80 mM Tris-HCI (pH 8.0), 20 mM MgCl2: 2x tavlama tamponu hazırlayın. </li><li> 5 U / ul Phi29 DNA polimeraz sulandırmak. </li><li> 50 ul rasgele heksamer primer (100 uM), 125 ul 2x tavlama tamponu ve 25 ul su içinde oluşan ön karışım örnek tamponu. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. </li><li> Ön-karışım, reaksiyon 100 ul Phi29 10x tampon oluşan tampon maddesi, 40 ul 10 mM dNTP ve 560 ul su. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. </li><li> 4 ul numune tamponu içine 1 ul şablon DNA ekleyin. </li><li> Th inkübeE, 3 dakika 95 ° C de ilave edilip buz üzerinde soğutulur. </li><li> , 2.4.4 den karışıma reaksiyon tamponu 14 ul ekleyin yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> , Phi29 DNA polimerazı 1 ul ilave edin ve yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın ve 10 dakika boyunca 65 ° C&#39;de, ardından 18 saat 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Genomik DNA sütunları veya fenol / kloroform ve etanol yağış kullanarak reaksiyonları temizleyin. </li></ol></li><li> Epifloresans Mikroskobu (Haas ve ark bakın. 2014 28 filtrasyon sistemi kurulumu için) Not: nükleik asit boyaları ile izolasyon ve saflaştırma, epifloresans mikroskopi sonra örneklerde viral partiküllerin varlığı ve saflık (Şekil 2A ve 2C) kontrol etmek için de kullanılabilir. Numunedeki serbest DNA yüksek eşiğe ortaya çıkmasına neden olabilir. Bu nedenle, örnek DNaz Mikrograflarda için tespit ve boyamadan önce I-tedavi olmalıdır. <ol><li> Montaj çözeltisi hazırlayın (% 0.1 askorbik asit, 50% gliserol). 1X fosfat tamponlu salin (PBS) 4.9 mi,% 10 askorbik asit 100 ul ekle, iyice karıştırın. Karışıma,% 100 gliserolden 5 ml ilave iyice karıştırın ve &quot;bağlama&quot; olarak tüp etiketleyin. </li><li> Filtre -20 ° C&#39;de bir 0.02 mikron alüminyum matris tek kullanımlık şırınga filtresi, mikrofüj tüplerine kısım ve deposunu kullanan monte edin. </li><li> Kısım 100, yeni bir mikrofüj tüpüne örnek ul VLP&#39;lerini düzeltmek için% 4 paraformaldehid eşit hacimde ilave edin. En az 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> 0.02 um filtre edilmiş su, 800 ul ilave edilerek 1 ml hacim tamamlanır. Tüp içine SYBR altın leke 1 ul eklenir ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> -9 Ve -10 psi (-62,1 -68,9 ve kPa) arasındaki vakum pompası açarak filtreleme sistemi kurun. </li><li> Su ile yıkayın ve kaidesini filtre kaide içine halka şeklinde polipropilen destek halkası ile bir 0.02 mikron alüminyum matris filtre yerleştirmek. </li><li> Bir kelepçe ile filtre ve güvenli filtre kaide üstünde bir filtre kule yerleştirin. </li><li> Örnek süzülmeye için bir kaç dakika filtre kulesi içine 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp içerikleri pipet, ve bırakın. </li><li> Mikroskobik slayt içine monte reaktif Etiket ve pipet 10 ul. </li><li> Filtre kulesi ve kelepçe çıkarırken vakumu bırakın. </li><li> Dikkatle filtre kaide filtreyi kaldırmak ve bir Kimwipe ile filtrenin alt kurulayın, ardından mikroskobik slaytta dağın tepesine doğrudan filtreyi yerleştirin. </li><li> Filtre üzerine monte ayıracı başka bir 10 ul pipet ve filtre üzerinde bir lamel yerleştirin. </li></ol></li></ol> 3. Yaratma Mikrobiyal metagenome <ol><li> Tampon ve çözeltilerinin hazırlanması <ol><li> 1x DNaz tamponu 50 ml hazırlayın: 50 mM NaAc, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2; pH 6,5&#39;e ayarlanır. Filtre sterilize (0.22 mikron) ve mağazaoda sıcaklığında karıştırılmıştır. </li><li> Ben Dornaz ünitesi / mg kuru ağırlık olarak tanımlanan aktivitesine göre liyofilize sığır pankreas Dnase gelen (moleküler sınıf su içinde) Ben 1000 U / ul enzim DNase hazırlayın. </li><li> GD tamponu, 100 ml hazırlayın: 75 mM NaCI, 25 mM EDTA, pH&#39;ı 7.5&#39;e ayarlayın. Oda sıcaklığında sterilize Filtresi (0.22 mikron) ve mağaza. </li></ol></li><li> DNA Ekstraksiyon için örnek Ön arıtma önce <ol><li> 0.22 um filtreden 1x PBS 5 hacmi eklenerek Homojenat seyreltin. Örneğin, örnek 2 ml 1 x PBS, 10 ml ilave ediniz. </li><li> % 2 (hac / hac) nihai konsantrasyona β-merkaptoetanol ekleyin. 2 saat süre ile oda sıcaklığında (kimyasal başlığı kullanılmıştır) karışımı sallayın. </li><li> 10 ° C&#39;de örnek Spin ve 15 dakika boyunca 3056 x g ve süpernatant atılır. </li><li> Moleküler sınıf, 10 ml su (ya da 0.22 um&#39;lik filtre edilmiş su) pelletini tekrar ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Tekrar bir kez 3.2.3 ve 3.2.4 adımları. </li><li> Spi10 ° C&#39;de, n ve 15 dakika boyunca 3056 x g ve süpernatant atılır. </li><li> 5 mi 1x DNase tamponu pelet yeniden süspanse edin ve örnek ml&#39;si başına 15 ul DNase I (1000 U / ml) ilave edilmektedir. </li><li> 2 saat boyunca karıştırma tekrar 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 15 dakika boyunca 65 ° C &#39;de, DNase etkinliğini aktif hale getirmesi. </li><li> 10 ° C&#39;de Spin ve 15 dakika boyunca 3056 x g ve süpernatant atılır. 10 mi SE tamponu içinde pelletini. </li><li> Adımı yineleyin 3.2.10. </li><li> 10 ° C&#39;de Spin ve 15 dakika boyunca 3056 x g ve süpernatant atılır. </li><li> 2 mi GD tamponu içinde pelletini ve iki mikrofüj tüplere aktarın. </li><li> Mikrofüj tüplerinde pelet hücreleri. 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında 16,100 x g&#39;de tüpler dönerler. </li><li> Süpernatantı ve genomik DNA ekstraksiyon kiti, Gram-pozitif değişimi protokolü kullanılarak pellet haline getirilen hücrelerinden DNA ekstrakte edin. </li></ol></li></ol> 4. Yaratma Metatranscriptome <ol><li> Örnek Ön-tedavi <ol><li> Hemen numune toplama ve homojenizasyon sonrası GITC-lizis tamponunda boncuk dayak hücrelerin mekanik lizisini gerçekleştirin. Adım 1.4 Bkz. </li><li> Silis boncuklar pelet haline getirildi, 5 dakika, 4 ° C de bir karışım, 600 xg dönerler. </li><li> Yeni bir tüp içine süpernatant aktarın. </li><li> Oda 10 dakika süreyle ve bir dönüş 4 ° C&#39;de ve 15 dakika boyunca 3,056 x g &#39;de inkübe, kullanılan GITC parçalama tamponu, her 750 ul kloroform ve 200 ul ekle 15 saniye boyunca elle kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Bu 15 dakika dönüş sırasında, adım 4.2 hazırlanmak. </li><li> 15 dakika kurutma (sulu faz interfaz Organik faz formları açık bir şekilde ayrılması), yeni RNaz içermeyen boru (lar) içine (interfaz bozmadan) sulu faz ekstrakte edin. NOT: Sulu faz, RNA&#39;yı ihtiva etmektedir. Bir sonraki safhaya kadar buz üzerinde tüpler tutun. </li></ol></li><li> Piyasada mevcut sütun tabanlı RNA arıtma kitleri veya conve kullanan toplam RNA ekstraksiyon ve saflaştırma gerçekleştirinntional izopropanol-tabanlı RNA yağış. <ol><li> Silika kolon bazlı RNA saflaştırma <ol><li> Elde edilen sulu fazın toplam hacmini ölçün. </li><li> Örnek ve iyice karıştırın RNA bağlama tamponu uygun hacim. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak bağlayıcı durumu uygun karışımın ayarlayın. İyice karıştırın ve kısa bir spin. </li><li> RNA sütuna karışımı yükleyin. Bir büyük hacimli numune için, birden fazla yükleme kullanmak ve 4x her sütun kadar yük. Aksi takdirde, her bir örnek için birden çok sütun kullanmayı düşünün. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak uygun sütunu yıkayın. </li><li> RNaz içermeyen su içinde en az 30 ul RNA tasfiye edilir. Çift yıkama biraz RNA verimini artıracaktır. Bununla birlikte, bu RNA konsantrasyonu seyreltecektir. </li><li> RNA konsantrasyonu ölçün ve DNaz Tedavi doğrudan geçin. RNA kalitesini kontrol etmek Bioanalyzer kullanın (önerilir). </li></ol&gt; </li><li> RNA Yağış <ol><li> Izopropanol eşit hacimde ekleme (örneğin, sulu fazın 500 ul içine izopropanol 500 ul) ve örnek 10 ug / ml RNaz içermeyen glikojen 2 ul. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> 12,000 xg&#39;de Spin ve 15 dakika boyunca 4 ° C. </li><li> Dikkatle, süpernatan RNase içermeyen% 75 etanol içinde 1 ml. Pelet sağlam olduğundan emin olmak için 7500 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de karışım dönerler. </li><li> Dikkatlice etanol çıkarmak. </li><li> Tekrar bir kez 4.2.2.4 ve 4.2.2.5 adımları. </li><li> Hava, 10 dakika boyunca pelet kurutulur. </li><li> RNaz içermeyen su, 50 ul pelet rehidrate, 5 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe etmek ve DNaz muamelesi ile doğrudan devam edin. RNA kalitesini kontrol etmek Bioanalyzer kullanın (Önerilen). </li><li> -20 ° C, ya da uzun süreli depolama için -80 ° C &#39;de parçalar halinde saklayın RNA. </li></ol></li></ol></li></ol&gt;

The authors have nothing to disclose.

Viral Metagenomiks Viral parçacıklar polietilen glikol (PEG), çökeltme ya da küçük hacimli konsantre edici kullanılarak konsantre edilmiştir. Bazı durumlarda, konsantrasyon gerekli olmayabilir, ancak ön-filtreleme ya da düşük hızda santrifüj adımları ökaryotik mikrobiyal hücreleri çıkarmak için kullanılır. Viral lisatlar daha zenginleştirilmiş ve yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon 9,41 veya küçük boyutlu filtreler (örneğin, 0.45 mikron) ökaryot ve büyük mikrobiyal hücrelerin 25 kaldırmak için. Kullanılarak saflaştırılmış olacak Yoğunluk gradyanı santrifüjü gibi teknikler tipik olarak izole edilmesi ve viral partikülleri 41 konsantre sükroz veya sezyum klorür gibi yoğun ama asal çözümler ile gerçekleştirilir. Fiziksel ayırma boyutu ve viral parçacıkların yüzer yoğunluğuna dayanır. Bu nedenle, filtre gözenek büyüklüğüne uygun seçim ve geçişlerini sıkı hazırlık fiziksel iyileşme başarısı olarak, spesifik viral toplulukları izole etmek için gerekli olanVLP&#39;ler 41 (ekstraksiyon yoğunluğu içinde filtre veya sonbaharda geçmesine yok yani, viral parçacıkların metagenome tespit edilmeyecektir) izole topluluk belirler. Virüs izolasyonu ve konsantre edildikten sonra serbest nükleik asit ve mikrobik ve ökaryotik hücre şeklinde hem de örnek olarak, viral olmayan genomik malzeme mevcut kirletici olabilir. Bu nedenle, numuneler içinde viral partiküllerin saflığa (Şekil 1A ve 1B) kontrol etmek çok önemlidir. Bir kloroform tedavi genellikle önce nükleik asit ekstre nükleik asitlerin indirgeme nükleaz işlenerek, ardından kalan hücrelerin, lize etmek için kullanılır. Sunulan iş akışına bir uyarı da CsCI degrade girmek için çok batmaz olabilir zarflı virüs partikülleri hariç olabilir gibi viral parçacıkların izole etmek yoğunluk gradyan ayrılık kullanımı oldu. Bir alternatif &quot;catch-all&quot; yöntemi yoğunluk gradyan Separ ihmal etmektirme 0.45 mikron topluluk DNA izole ve - kloroform ve DNaz I. Bu yaklaşım ile tedavi süzüntülerden gibi bezlerden veya kan plazmasından gibi küçük bir örnek hacimleri karşılamak için de uygundur. Bununla birlikte, bu kloroform dirençli bakteriyel kontaminasyon ve DNase I dirençli hücre dışı DNA&#39;nın daha yüksek bir miktarda neden olabilir. Yüksek DNA dizileme verimleri seçenekleri daha geniş bir seçenek sunmak sayede Güncel sıralama protokolleri 1 ng sıralama kütüphane hazırlanması için nükleik asitlerin ug 1 gerektirir. Oluşturulan viromes DNA konsantrasyonu genellikle 200&#39;den fazla ng / ul algılama sınırının altında arasında değişmektedir. geri kazanılan viral nükleik asit miktarı, doğrudan dizileme kütüphane hazırlanması için yetersiz olabilir. Bu gibi durumlarda, nükleik asit amplifikasyon gereklidir. Bağlayıcı amplifikasyon tüfek kütüphaneleri (LASLs) 2,42,43 ve çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) dayalı tüm genom amplifikasyon iki vardıryöntemler, genellikle dizileme için yeterli DNA üretmek için kullanılmaktadır. Bu tür Phi29 DNA polimerazı ilgili olanlar MDA yöntemleri amplifikasyon önyargılara muzdarip bilinmektedir ve tercihen niceliksel olmayan taksonomik ve fonksiyonel karakterizasyonu 44,45 sonuçlanan ssDNA ve dairesel DNA arttırabilir. LASLs yaklaşım optimize edilmiş bir versiyonu, sadece minimal önyargıları tanıtmak için gösterilen (başlangıç ​​materyalinin küçük miktarlarda) yüksek hassasiyet teşvik ve kolayca farklı sıralama platformları 43 için uyarlanmıştır edilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, bir çok aşamaya sahiptir, DNA kaybını en aza indirmek için özel ekipman gerektirir ve dsDNA şablonları ile sınırlıdır. Laboratuvarımızda, bu yaklaşım başarılı bronkoalveoler lavage-, coral- ve deniz suyu kaynaklı VLP&#39;lerden (yayınlanmamış ve Hurwitz ve ark. 46) elde DNA tespit ve saptanamayan bir miktar yükseltmek için adapte edilmiştir. Veri analizi hatlarının geliştirilmesi cla vardırssically nedeniyle viral toplulukların oldukça çeşitli ve büyük ölçüde bilinmeyen doğa viral metagenomik analizinin en zorlu yönlerinden biri olmuştur. Tarih güncel virüs veritabanlarına biyosferdeki tahmini 10 8 viral genotipleri, orada iken bu yaklaşık toplam viral çeşitliliğin yaklaşık 1/100000 olduğunu ~ 4.000 viral genomları içerir. Bu nedenle, viral metagenomes taksonomik ve fonksiyonel atama için (örneğin BLAST 47 gibi) benzerlik-tabanlı aramalar doğasında zorluklarla sahip. Birçok dizileri veritabanında genomları önemli benzerlikler var başarısız, ve bu nedenle, bilinmeyen olarak sınıflandırılır. Homoloji-esaslı arama sınıflandırma atanması için en önemli uygulama ve veri sırası işlevini de, veritabanı bağımsız analizine göre alternatif yaklaşımlar 48- 50 geliştirilmiştir. Fancello ark. 51 vira kullanılan hesaplama araçları ve algoritmaları tam inceleme sağlamakl metagenomik. Mikrobiyal Metagenomiks Tipik haliyle, hipotonik liziz ile tedavi edilen mikrobiyal topluluğu (HL-DNA) elde edilen DNA&#39;nın toplam miktarı 20 ng den 5 ug arasında değişir. Verim, hastanın sağlık durumuna ve bu çalışma (Tablo 2) özütlendi HL-DNA toplam verimle görülen varyasyon açıklanmaktadır toplanan yaymadan miktarı, son derece bağlıdır. kritik adımlar. Kaliteli dizi verileri oluşturulan sıralama kütüphanelerinin kalitesine güveniyor oluşturmak 2 enzimatik-tabanlı DNA parçalanma prosedürü kullanılarak CF balgam kaynaklı mikrobiyal DNA&#39;dan üretilen sıralama kütüphaneleri için tipik bir boyut aralığı gösterir Şekil. Optimal kütüphane büyüklüğü dizileme platformu ve uygulama seçimine bağlıdır, ve gerekirse, bu nedenle, parçalanma prosedür, sonifikasyon ve nebülizasyon gibi alternatif yaklaşımlar yoluyla, optimize edilebilir. Ek olaraksunulmuştur temsili sonuçlar, çoklu zaman noktalarında, çeşitli hastalardan alınan CF balgamının sunulan yöntemin başarısı (2012) 9. Lim ve diğerleri içinde tasvir edilmektedir ve Lim ve diğerleri. (2014), 10. Önceki çalışmalarda 9,10, her hasta dalgalanmaları nedeniyle antibiyotik tedaviler gibi tedirginlikler muhtemel iken, böylece toplum içinde önemli oyuncuların devamlılığını yansıtan, zamanla geçer mikrobiyal topluluğun bir dizi benzersiz barındırır öneririz. Bu dalgalanmalar bile dış tedirginlikler olmadan veya bağlı örnekleme prosedürü ve örnek işleme günlük meydana olsun, söz hala. HL-DNA metagenomic ve 16S rDNA amplikon analizine dayanarak, 7 günlük uzunlamasına örnekleme gösteren antibiyotik pertürbasyon mikrop profillerin günlük dalgalanma (Gün 1, 2, ve 3) olan en az (Şekil 3A ve 3B). Intro üzerineantibiyotik siprofloksasin gibi P. olarak bilinen bakteriyel patojenler geniş bir yelpazede hedef iken oral antibiyotik duction hemen Gün 3 örnekleme sonra, topluluk profilinde değişiklikler Gün 4. belli oldu aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Streptococcus pnömoni, tedavi P. göreceli olarak artmış aeruginosa Streptococcus spp düşürürken. ve P. melaninogenica. Gün 6 olarak, toplum yavaş yavaş ilk başlangıç ​​toplum yapısına kurtarıldı. Sonuçlar, tek bir hastada içinde mikrobiyal profillerin dalgalanmalar nedeniyle hava yollarında toplum tedirginlikler daha olası olduğunu göstermektedir. HL-edilen DNA&#39;dan 16S rDNA kütüphaneler ve metagenomes mikrobiyal profiller arasında tutarlılık göz önüne alındığında, bu çalışmada kullanılan 16S rRNA primerleri kaynaklanan önyargıları dışladı. 16S rDNA Taksonomik genelinde görülen farklılıkların olası bir açıklamatoplam DNA ve HL-türevli DNA (Şekil 3B) elde ark profilleri Pseudomonas türlerinin yüksek miktarlarının varlığı olabilir. antibiyotik tedavisi sonrası hücre dışı bir DNA. Bu bu farklılıklar Gün 7 en belirgin olduğu bulgularla desteklenen, üç gün Pseudomonas spp hedefleyen antibiyotik tedavisi, sonra. diğerleri yanında. Siprofloksasin yaygın CF ve kronik P. hastalarda ilk basamak tedavi olarak kullanılır faaliyet spektrumu en CF-ilişkili patojenleri içeren olsa aeruginosa enfeksiyonu. Biz antibiyotik tedavisi Streptococcus spp duyarlı toplulukları ortadan kaldıracak varsayıldı. ve dolayısıyla dirençli P. tarafından doldurulan bir niş oluşturmak aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kendi biyofilm toplulukları artırarak direnç kazanabilir ve hücre dışı DNA kendi biyofilm mimarisi 52 ana yapısal destek olduğu gösterilmiştir. Hatta t olarakO topluluk yapısı dışı DNA CF balgam kalmış olabilir, iyileşti. Bu nedenle, bu veriler hipotonik parçalama ve potansiyel sadece insan kaynaklı DNA kaldırarak değil yarar bu iş akışında sunulan yıkama adımları, ama aynı zamanda mikrobik kaynaklı dışı DNA gerçek mikrobiyal profilleri yanlış olabilir öneririz. Metatranscriptomics Yüksek kaliteli bir metatranscriptome nispeten az ribozomal RNA (rRNA) dizileri içerir ve yorumu transkript (mRNA) &#39;nın tarafsız bir örnekleme temsil etmelidir. Nedeniyle mRNA kısa yarılanma ömrü ve sınırlı miktarda, bu protokol, burada gösterildiği gibi, geri kazanılan transkript sayısını en üst düzeye çıkarmak için örnek işlemlerine en aza kritiktir. Son yıllarda, rRNA azaltımı için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir ve ticari olarak temin edilebilen kitler uyarlanmıştır. Bunlar MicroB zenginleştirin, Ribo-Zero, ve örnek özgü Subtractive h dahilybridizations oligonükleotid hibridizasyonu, ve 5 &#39;monofosfat içeren ekzonükleaz enzimatik aktivitesi hedef RNA dayanmaktadır mRNA sadece kit dayanmaktadır 53. Buna ek olarak, bu tür tercihen doğrusal RNA&#39;yı polyadenylates ve güçlendirir MessageAmp II-Bakteri Kit olarak mRNA zenginleşme için çeşitli yaklaşımlar da mevcuttur. Bu yöntemlerin (örneğin, mRNA-SADECE, MicroB E xpress ve MessageAmp) Bazı optimum verimlilik için aynı anda kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, tüm etkinliği kısmen bozulmuş rRNA ile çalışan genellikle CF örneklerinden ekstrakte edilen toplam RNA gözlenen özellikle sınırlıdır. Poliadenilasyon bağımlı RNA amplifikasyonu, hem ökaryotik ve prokaryotik mRNA oluşan metatranscriptomes oluşturmak için kullanılamaz. Buna ek olarak, poli (A) kuyruğu I yararlı dizi veri miktarını azaltır olabilir dizilere eklenir. Homopolimer uzanıyor Bölgeler düşük kalite puanları eğiliminde olacaktır, cönemli sayıda ausing poli kapalı kırparak sonra sıralama ve sonrası sıralama yazılım ve ortalama faydalı okuma uzunluğu tarafından filtre edilecek okur (A) kuyrukları anlamlı 54 azalacaktır. Karmaşık CF mikrobiyal topluluklar ve kısmen bozulmuş RNA (Şekil 4A ve 4C) ile ilgilenmek, önceki çalışma Ribo-Zero Altın kiti ile hibridizasyon-yakalama yöntemi kullanarak birleştirmek tedavilere kıyasla insan ve mikrobiyal rRNA hem giderilmesinde daha etkili olduğunu gösterdi Diğer kitleri 9 (Tablo 3). Elde edilen veriler, insan ev sahibi ve mikrobiyal transkript hem eşzamanlı analiz sağlar. Verim ve RNA kalitesi, hem de sekanslama platformun nihai seçime bağlı olarak, cDNA sentez adımı da dahil olmak üzere, bu işlemlerin bir çok sekans kitaplığı üretimi ile aerodinamik edilebilir. Örneğin, ribo-sıfır tedavi RNA metatranscriptome dizileme Terazi yapmak için kullanılabilirRies ScriptSeq RNA-Seq Kütüphane Hazırlık kiti kullanılarak. Hayvan ilişkili toplulukların metagenomic analiz host ve ilişkili topluluklar içeren genel fonksiyonel varlık kapsamlı bir temsilini sağlar. Burada yer alan iş akışı, özellikle, arzu edilen viral ve mikrobiyal ek olarak kalın mukus, hücre artıkları, hücre dışı DNA, protein ve glikoprotein kompleksleri, yüksek miktarlarda, hem de konakçı hücreleri içeren bu karmaşık hayvan ilişkili örnekleri çeşitli uyarlanabilmektedir parçacıklar. Virütik ve mikrobik parçacıkların her adımda kaybolabilir bile, izolasyon ve saflaştırma, ana DNA&#39;nın miktarının en aza düşürülmesi için gerekli olan parçacıklar. Metagenomik verileri incelendiğinde toplulukların metabolik potansiyellerini sağlarken, kodlanmış fonksiyonların 9 diferansiyel ifadesi ortaya koyarak bu tamamlayıcı metatranscriptomics. Genomik ve transkript verileri kapsamlı bir değerlendirme, yeni ins vermiştirtoplum etkileşimleri dinamiklerine ights ve iyileştirilmesi tedavilerin 9,10,55 gelişimini kolaylaştırır.

<html> Insan vücudu ile ilişkili viral ve mikrobiyal topluluklar sekans teknolojilerini 1,2 uygulanması yoluyla, son on yıl içinde yoğun bir şekilde araştırılmıştır. sonuçları insan sağlığı ve hastalıkları önemi mikropların tanınmasına yol açmıştır. büyük girişim, insan derisi üzerinde bulunan bakterileri açıklar insan mikrobiyomları projesi (ve bazı archaea) geldi ve sözlü boşlukların, hava yollarında, ürogenital sistemde, ve gastrointestinal sistem 3 içinde. Bronşalveol lavaj (BAL) 4,5 ve nazofarengeal sürüntü 4 ile sağlıklı insan hava yollarının daha fazla mikrobiyomları çalışmaları akciğer çevre örnekleme cihazı, solunum yollarında geçici mikrobiyal kolonizasyon sonuçları olarak hizmet olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, bozulmuş solunum yolu yüzeyleri mikrobiyal kolonizasyon etkisi, Kistik Fibroz (CF) hastalarda görülen gibi ciddi ve kronik akciğer enfeksiyonu, yol açabilir. t &quot;&gt; CF Kistik Fibrozis Transmembran Regülatör (CFTR) mutasyon geni 6 neden ölümcül bir genetik hastalıktır. Bu mutasyonlar da epitelin apikal yüzeyi boyunca transepitelyal iyon taşıma etkileyen arızalı CFTR proteinleri doğuran. Hastalık etkiler çoklu organ sistemleri, ancak mortalite ve morbidite çoğunluğu CF akciğer hastalığı 7 kaynaklanmaktadır. CF akciğer mikrobiyal kolonizasyon için eşsiz bir ekosistem sunmaktadır. iyon taşınmasında kusur aerobik oluşan mikroçevrelerde oluşturarak, CF hava yollarında kurmak için mukus neden Statik besin yönünden zengin mukoza yüzeyi tarafından demir mikroaerofilik, anaerobik bölmeleri. Bu ortam virüs, bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere kolonizasyon ve mikropların çoğalmasını kolaylaştırır. akut ve kronik akciğer mikrobik enfeksiyonların yapan ve sabit fakat etkisiz immün yanıtlara neden geniş hava yolu yeniden, pulmoner kapasite kaybı ve sonuçta pulmoüriner başarısızlık. CF akciğer ile ilgili bakteriyel topluma iyi 16S ribozomal RNA (rRNA) ya, gen dizilim 8 ve av tüfeği Metagenomiks 9,10 kullanılarak dahil, her iki kültür bağımlı ve Kültür bağımsız yaklaşımlar kullanılarak tarif edilmiştir. 16S rRNA bazlı bir mikrop türleri geniş bir tanımlama ve topluluk çeşitliliği geniş kaymalar yakalamak edebilmektedir. Ancak, toplulukları tanımlayan kendi çözünürlüğünde sınırlıdır (. Claesson ve ark 2010 11 özetlenmiştir) ve metabolik potansiyellerinin tahminleri belirlenen takson için bilinen genel işlevleri sınırlıdır. Bu nedenle, 16S rRNA gen sıralama yöntemleri CF akciğerlerde bulunan çeşitli mikrobiyal toplulukların gerekli taksonomik ve fonksiyonel analitik doğruluk için yetersizdir. Burada anlatılan metagenomic yaklaşım sınırlamalar üstesinden, 16S rRNA-temelli bir yaklaşım tamamlar ve nispeten etkili bir şekilde sağlarmikrobiyal topluluk taksonomi ve CF akciğerlerde genetik içeriğini hem de analiz etmek. Hayvan ilişkili örneklerinden izole mikrobiyal DNA, genellikle ana DNA&#39;nın büyük bir miktarda içerir. 14 - CF balgamı veya akciğer doku örnekleri genellikle immün yanıt olarak nötrofiller tarafından serbest insan DNA&#39;sının büyük miktarda, toplam DNA 12 genellikle% 99&#39;undan daha fazlasını ihtiva etmektedir. Bazı bozulmamış bir insan hücreleri mevcut olabilir, ancak bu DNA&#39;nın çoğu çözelti içinde serbest veya mikropların yüzeyine adsorbe edilir. Buna ek olarak, son derece ağdalı mukus tıkaçları, hücresel enkaz ve diğer bilinmeyen kirleticilerin varlığı daha da mikrobiyal hücrelerin izolasyonu zorlaştırıyor. Çeşitli yöntemler seçici insan DNA&#39;sı 16 ve MolYsis kiti, sınırlı başarı ile bütün indirgeme etidyum bromür monoazide mikrobiyal hücrelerin 15 ayrı insan DNase I ile işleme tabi için Percoll gradyenleri dahil olmak üzere insan DNA Bu örnekleri, tüketen için test edildi.<html> CF balgamının için en etkili mikrobiyal DNA saflaştırma prosedürü Bugüne kadar Breitenstein ve arkadaşları tarafından tarif edilen işlemin bir tadilatı olmuştur. (1995) 17. Burada hipotonik lizis (HL) yöntemi olarak bilinen bu yaklaşım, müsin disülfid bağları, ökaryot hücrelerin hipotonik lizis ve çözünebilir DNA 9 DNaz I tedavi azaltmak için β-mercaptoethanol bir kombinasyonunu kullanır. Alternatiflerin olmamasına rağmen HL yöntemi nedeniyle (i) bazı endişeleri istenmeyen mikropların lizisinden ve kaynaklanan olası önyargıları kaldırdı (ii) toplum bileşiminde 9,10 gözlenen dalgalanmalar örnek işleme ile ilişkili varyasyonların bir eserdir olup olmadığını. Av tüfeği metagenomes nesil ek olarak, biz toplam DNA ve yedi gün üst üste genelinde tek bir hastadan toplanan balgam örneklerinin aynı seti kullanarak HL yöntemiyle elde mikrobiyal DNA&#39;nın 16S rRNA gen profilleri karşılaştırarak bu konuları ele. mikrobiyal topluluklar karşılaştırıldığında ent &quot;&gt;, hayvanlar ile ilgili viral toplulukların karakterizasyonu sınırlı 18,19 CF solunum yollarında virüs topluluklar sadece minimal 20 karakterize edilmiştir -.. 22 CF hava yollarında viral toplulukların DNA karakterize ilk metagenomic çalışma CF akciğerlere ile ilişkili en virüsler fajlar 20 olduğunu gösterdi. CF ve non-CF bireylerde faj metabolik potansiyeli önemli ölçüde farklı oldu. Özellikle, CF bireylerde faj toplulukları CF solunum yollarının fizyolojisine bakteriyel konak uyarlamaları yansıtıcı genleri taşınan, CF akciğer dokusunun virüslerin bakteriyel hastalık oluşturma 20. Daha sonra metagenomic çalışmalar anatomik bölgelerine 22 arasında virüs toplulukları farklı mekansal heterojenlik olduğunu göstermiştir. Ayrıca, CF akciğer dokuları, herhangi bir eko-22 bugüne kadar gözlenen en düşük virüs çeşitlilik barındırmıştır. belirlenmiş olan en virüs fajlar edildipotansiyeline sahip CF patojenleri bulaştırmak için. Bununla birlikte, bu herpes, adenovirüsler ve insan papilloma virüsleri (HPV) gibi ökaryotik virüsler de tespit edilmiştir. Akciğer dokusunda kistler diseksiyonu sırasında gözlendi bir olay, olarak, bir insan papilloma virüsü genomunun fazla% 99 hasta pulmoner papillom veya karsinom tanısı asla olsa bile, elde edildi. Bu viral çeşitlilik, mevcut doku hasarının ciddiyetini yansıtan, aynı zamanda teşhir ve altta yatan hastalığı uncharacterized açıklayabilir sadece gösterir. Burada anlatılan protokollerin kalın mukus, ev ve mikrobiyal hücreleri, serbest DNA, aynı zamanda, hücre kalıntılarının büyük miktarlarda oluşan örneklerinden virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) izole etmek için basit, ancak güçlü bir yöntem sunar. Metagenomics tamamlayan metatranscriptomics mikrobiyal eden ve ev sahibi 9,23 gen ekspresyonu dinamikleri izlemek için kullanılır. Bu durumda, her iki mikrobiyal ve HOSt mRNA tercihen seçilmesi gerekir. Bakteriyel mRNAlar poliadenileştirilmiştir olmadığından, bir oligo-dT-tabanlı mRNA açılan yöntemi yararlanılamaz. Numuneler ökaryotik mRNA miktarları ihtiva bilinen durumunda poliadenilasyon bağımlı RNA amplifikasyonu ana ilişkili örneklerde kullanılamaz. CF balgamının dahil olmak üzere birçok hayvan ilişkili örnekleri, RNaz&#39;larına içeren, yüksek hücre kalıntılarının miktarları ve nükleazlardır ek olarak hücrelerin yüksek yoğunluğa içerir. Bu nedenle başka bir zor bir görev metatranscriptome işlem sırasında geniş RNA bozulmasını önlemektir. Pek çok durumda, CF balgamının ekstrakte edilen toplam RNA, elde edilen RNA alt baş uygulamaları ve yardımcı sınırlama kısmen parçalanır. Son yıllarda, rRNA azaltımı için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir ve ticari olarak temin edilebilen kitler uyarlanmıştır. Bu yaklaşımların etkinliği ancak özellikle kısmen bozulmuş rRNA 9,24 ile çalışırken, sınırlıdır. Burada kullanılan yöntemler izinverimli mansap toplam rRNA çıkarılması için uygun kısmen bozulmuş toplam RNA alımı için ed. İki farklı kitleri karşılaştırarak kısmen bozulmuş toplam RNA&#39;dan rRNA kaldırma verimliliği doğrudan karşılaştırma Lim ve arkadaşları tarafından izah edildi. (2012) 9. Genel olarak, bu yazının amacı örnek olarak uyarılmış balgam numunesi kullanılarak, tek bir hayvan ile ilişkili örnek protokollerin tam bir set virütik ve mikrobik tüfek metagenomes oluşturmak için (Şekil 1) ve bir metatranscriptome sağlamaktır. Moleküler laboratuvar iş akışı çapraz bulaşmayı en aza indirmek için ayrı öncesi ve sonrası amplifikasyon alanlarını içermelidir. yöntemler, dokusu 22, nazofaringeal ve orofaringeal sürüntü 25, bronkoalveoler lavaj (BAL) ve mercan (yayınlanmamış veri) gibi diğer örnek türlerine kolaylıkla uyarlanabilir. Her numune toplama üzerine hemen işleme özellikle mikrobiyal metagenomik ve yerine getirilmesi gerekenatranscriptomics çalışmalar arzu edilir. Numuneler dondurulmuş, bu potansiyel hücre bütünlüğünü bozabilir dondurma gibi mikrobiyal metagenomes için temas halindeki mikrobik hücrelerin izolasyonu sınırlar. Bununla birlikte, donma metatranscriptomics ve viral izolasyon ama donma-çözülme süreci etkilenebilir geri kazanılan viral partiküllerin RNA kalitesi ve miktarı engel teşkil etmez. O uyarılmış balgam BAL çok invaziv olabilir gibi erişkin KF hastalarının ve diğer kronik akciğer hastalıkları 26,27 ile ilgili birçok çalışmalarda numunelerin birincil kaynağı olarak görev yapmaktadır dikkat etmek önemlidir. Bizim çalışmalarda, balgam örnekleri gargara ve en az balgam örneklerinin içinde sözlü mikroplar kontaminasyonu tutmak için steril tuzlu su çözeltisi ile ağız boşluğunun durulama sonrasında dikkatli ve tutarlı bir örnekleme yöntemiyle, yani, ile toplanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

Yüksek verimlilik sıralaması erişilebilirlik biyoloji birçok alanda devrim yarattı. Iyi bir başlangıç ​​ile ilişkili viral ve mikrobiyal topluluklar anlamak için, DNA ve RNA ekstresi için kapsamlı bir iş akışı geliştirilmiştir. iş akışı aynı zamanda, yeni nesil dizileme için, tek bir numuneden virütik ve mikrobik metagenomes yanı sıra metatranscriptomes oluşturur. Bu yaklaşımların birleştirme Taksonomik özellikleri ve toplum kodlanmış fonksiyonların hem genel bir bakış sağlar. o derece ağdalı ve müsinlerin yüksek miktarda, serbest nötrofil DNA ve diğer bilinmeyen kirletici içerdiğinden sunulan yöntemler, Kistik Fibrozis (KF) balgam, sorunlu bir örnek türü kullanın. Burada anlatılan protokoller bu sorunları hedef ve başarılı minimal insan DNA kontaminasyonu ile viral ve mikrobiyal DNA kurtarmak. Metagenomik çalışmaları tamamlamak için, bir metatranscriptomics protokolü hem mikrobik kurtarmak için optimize edildiaz sayıda ribozomal RNA (rRNA) dizileri içerir ve ana oluşturulmaktadır. Veri özellikleri bir bakış yöntemleri başarısını değerlendirmek için bir referans olarak hizmet sunulmaktadır. Ek CF balgamı örnekleri de, (i) bir hastada içinde yedi ardışık gün boyunca mikrobiyomları profilleri tutarlılığını değerlendirmek, ve (ii) bir 16S ribozomal RNA gen temelli sekanslamasına metagenomic yaklaşım tutarlılık karşılaştırma toplanmıştır. Sonuçlar antibiyotik pertürbasyon olmadan mikrobiyal profillerin günlük dalgalanma az ve sık CF-ilişkili bakterilerin taksonomisi profilleri hipotonik lizis (HL) türevi DNA üretilen 16S rDNA kütüphaneler ve metagenomes arasında son derece benzer olduğunu göstermiştir. Hipotonik lizis ve yıkama basamağı, sadece insandan türetilmiş DNA çıkarılması değil yarar göstermektedir Bununla birlikte, 16S rDNA taksonomik profilleri arasındaki fark toplam DNA ve HL-edilen DNA&#39;dan üretilen, aynı zamanda extracellul mikrobiyal türevliGerçek mikrobiyal profilleri yanlış olabilir ar DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K Görüntüleme.  San Diego State University.  Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir. 

Video: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

Plazmid DNA Qiagen Miniprep Kit kullanarak Bakteri kolonileri Arındırıcı

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Biyoloji

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Brüt Diseksiyon Lobster Mide, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Kompleks Biyolojik örnekler seçerek glikozile Peptitler zenginleştirin lektin HPLC Yöntemi

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...