Bu protokol, gen fonksiyonu çalışması ve bakteriler için mutantları izole etmek üzere kromozomal genleri inaktive etmek için kullanılabilir. Homolog rekombinasyon işlemini basit, hızlı ve son derece verimli hale getirir. Bu tekniği kullanarak, zayıflatılmış aşı için aday olarak kullanılabilecek zayıflatılmış mutantı elde etmek için patojenin virülansla ilişkili genleri silinebilir.
MicC geninin hemoloji parçalarını içeren kloramfenikol kasetini yükselterek başlayın. MikC geninin beş asal ve üç asal ucundan 50 baz çifti homoloji uzantısı da dahil olmak üzere plazmid PKD3'ten kloramfenikol kasetini yükseltmek için ileri ve geri primerler tasarlayın. Kloramfenikol kasetini yükseltmek için PKD3 plazmidini şablon olarak kullanarak metin makalesinde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirin.
Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu belirleyin. Daha sonra ürünü bir DNA jeli geri kazanım kiti ile saflaştırın ve spektrofotometri ile DNA konsantrasyonunu belirleyin. PKD3 plazmidi tarafından daha fazla rekombinasyon girişimini ortadan kaldırmak için ikinci bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin.
İlk PCR ürününü 1 ila 200 oranında seyreltin ve ikincil PCR için bir şablon olarak kullanın. İlk rekombinant suşu 50336 delta micC nokta kedisini oluşturmak için, 100 mikrolitre SE 50336 yetkin hücreyi beş mikrolitre PKD 46 plazmid ile karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Isı, karışımı 90 saniye boyunca 42 santigrat derecede şoklayın ve plazmidi hücrelere dönüştürmek için iki dakika boyunca hızla buz üzerinde geri aktarın.
Hücreleri bir gecede 30 santigrat derecede ampisilin dirençli bir plaka üzerinde kültürleyerek pozitif kolonileri tarayın. Ertesi gün, SE 50336 PKD 46 sıvı kültürüne 30 mili daha fazla L arabinoz ekleyin ve sallanırken 30 santigrat derecede bir saatlik inkübasyonla rekombinaz ekspresyonunu indükleyin. Saflaştırılmış PCR ürününün 100 nanogramını ve 40 mikrolitre SE 50336 PKD 46 yetkin hücreyi bir elektrik çarpması kabında karıştırın.
Daha sonra elektrik çarpması dönüşümü gerçekleştirin. Elektro dönüşümden sonra, karışımı bir mililitre SOC ortamına ve bir saat boyunca 150 RPM ve 30 santigrat derecede bir sallama kültürü inkübatörüne aktarın. Pozitif kolonileri taramak için karışımı kloramfenikol dirençli bir LB plakasına ve kültürüne gece boyunca 37 santigrat derecede yayın.
Pozitif kolonileri iki saat boyunca 42 santigrat derecede kültürleyin. Daha sonra, PKD 46 olmadan ilk rekombinant suşu elde etmek için koloninin ampisilin'e duyarlılık ve kloramfenikol'e karşı direnç açısından gece boyunca 37 santigrat derecede taranması. PCR ve jel elektroforezi kullanılarak 50336 Delta micC nokta kedi genomik DNA'sını çıkardıktan sonra, elektroplaka 100 nanogram plazmid PCP 20, 40 mikrolitre 50336 Delta micC nokta kedi yetkin hücrelerine dönüştürüldü.
Hem ampisilin hem de kloramfenikol dirençli plakalardaki pozitif transformantları 30 santigrat derecede tarayın. Pozitif dönüştürücüleri dirençli olmayan LB sıvı ortamına aktarın ve gece boyunca 42 santigrat derecede kültüre alın. Daha sonra tek kolonileri 37 santigrat derecede bir LB plakasında izole edin.
Hem ampisilin hem de kloramfenikol'e duyarlı koloni seçin. Bu mutant, micC silme mutantı SE 50336 Delta micC'dir. Metin makalesinde açıklandığı gibi PCR gerçekleştirerek 50336 Delta micC'yi doğrulayın.
Bu protokol, iltifat edilen mutant 50336 Delta micC, pmicC'deki silme mutantı 50336 Delta micC'yi oluşturmak için kullanıldı. İlk rekombinant 50336 Delta micC nokta kedisi, vahşi tip suştaki 279 baz çiftine kıyasla, kloramfenikol yerleştirmeli yaklaşık 1200 baz çift PCR ürününün beklenen bant büyüklüğü ile PCR tarafından doğrulandı. İkinci rekombinasyonda, kloramfenikol kaseti PCP 20 tarafından elimine edildi.
Dizileme ile birleştirilen PCR sonuçları, izojenik micC mutantının başarıyla inşa edildiğini doğruladı. 50336, 50336 Delta micC ve 50336 delta micC pmicC suşlarında ompA, ompC ve ompD genlerinin ekspresyonu gerçek zamanlı kantitatif PCR ile analiz edildi. OmpA ve ompC ve 50336 delta micC'nin transkripsiyonu, vahşi tip suşa kıyasla yaklaşık 2.2 kat ve üç kat artmıştır.
OmpD'nin transkripsiyonu sadece biraz artarken. LD 50 tahlilleri, altı ila sekiz haftalık BALB / c farelerini üç suşun her biriyle enfekte ettikten sonra, 50336 Delta micC ile enfekte olmuş farelerin çoğunun, enfeksiyondan 48 saat sonra halsizlik, iştahsızlık veya ishal gösterdiğini ve 96 saat sonra öldüğünü göstermiştir. Vahşi tip suş ve 50336 delta micC pmicC ile enfekte olan fareler, enfeksiyondan 72 saat sonra aynı semptomları gösterdi ve 120 saat sonra öldü.
Üç suşun LD 50'leri, mutant 50336 Delta micC'nin virülansının vahşi tipe kıyasla 2.5 kat arttığını gösterdi. Bu teknik, araştırmacıların bakteriyel genlerin işlevini incelemelerine ve hedef genleri silerek istenen mühendislik suşunu elde etmelerine yardımcı olur.
