Bu, kardiyomiyositlerin ekokardiyografi rehberliğinde, perkütan intramiyokardiyal enjeksiyonunun, insan iPS kaynaklı kardiyomiyositlerin onarıcı özelliğini önemli ölçüde artırdığını gösteren ilk rapordur. Bu yöntem, insan iPS kaynaklı kardiyomiyosit tedavisi için uygulanabilir, tatmin edici, tekrarlanabilir daha az invaziv ve etkili bir prosedürdür. Perkütan intramiyokardiyal doğumun, iskemik kalp hastalığı, miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi hastalıklarda lokal ilaç dağıtımı için güvenli ve etkili bir yöntem olduğuna inanıyoruz.
Bu proje Profesör Jinfu Yang ve Profesör Jun Peng tarafından denetlenmektedir. Prosedürü gösteren Xun Wu, Kele Qin ve Kun Xiang, laboratuvarımdan MD PhDs ve Hunan İl Kardiyovasküler Araştırma Anahtar Laboratuvarı'ndan doktora yapan Di Wang olacak. Başlamak için, vakum, 60 günlük bir hiPSC-CM kültüründen kültür süpernatantını aspire eder.
Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hiPSC-CM'leri, hücre ayrılma enzim karışımını üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede kullanarak tek tek hücrelere ayırın. Hücreleri beş mililitre RPMI artı B27 ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve karıştırın.
Hücreleri sayın ve toplam hücre sayısını hesaplayın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300G'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peleti kardiyomiyosit destek ortamında, mikrolitre başına 4. hücrelerin 6 x 10'luk bir konsantrasyonuna kadar yeniden askıya alın.
Enjeksiyon adımına kadar tüpü 37 santigrat dereceye yerleştirin. Fare yeterince uyuşturulduktan sonra, uzuvları ve kuyruğu bantla sabitleyin. Ardından, fare kesici dişlerini 2/0 ipek iplik ve bantla sabitleyin.
Medyan boynu ve sol göğsü üç alternatif betain turu ve ardından alkol ile sterilize edin. İnce anatomik makas ve ince diseksiyon forsepsleri kullanarak medyan boyun insizyonu yapın. Trakeayı stabilize etmek ve tamamen açığa çıkarmak için birkaç ön servikal kası kesin.
20 gauge kateter delinme iğnesini ağızdan trakea tüpü olarak yerleştirin. Trakea tüpünü ventilatöre bağlayın ve her iki akciğerin de iyi havalandırıldığından emin olmak için torasik hareketi kontrol edin. Solunum parametrelerini ayarlayın.
Ardından, sol arka bacağı sağ alt tarafa sabitleyin ve sol üst ekstremitenin etrafındaki bandı gevşetin. İnce diseksiyon makası ve forsepsle, sol toraksın üç ila dört interkostal boşluğunda torakotomi yapın. Forseps kullanarak, perikarddan soyun ve sol ön inen koroner arteri bulun.
Arterin proksimal ucunu bağlamak için 6/0 ipek iplik kullanın. Akut miyokard enfarktüsü modelinin oluşturulmasını sağlamak için, ligasyon bölgesindeki arterin distal tarafı kırmızıdan beyaza değişene kadar bekleyin. Göğüs tabakasını katman katman kapatın ve cildi 4/0 iplikle dikin.
Sahte hayvan grubu için, ligasyon hariç tüm cerrahi prosedürleri uygulayın. Miyokard enfarktüsünü takip eden ilk iki haftada, fareleri% 5 izofloran ile bağlantılı bir anestezi kutusuna yerleştirin ve trakeal entübasyon yapın. HiPSC-CM'leri uygulamadan üç gün önce, siklosporin A'yı intraperitoneal boşluğa günde kilogram başına 10 miligramlık bir dozda enjekte edin.
Tüyleri farenin göğsünden ve üst karnından tüy dökücü kremle çıkarın. Kalp atış hızı dakikada 400 ila 500 atımda tutulana kadar besleme inhalasyon izofloranı. Fare uzuvlarını ve kuyruğunu algılama konsolundaki bantla sabitleyin ve platform sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Ultrason jölesini üst karın bölgesine uygulayın. Yüksek çözünürlüklü bir veteriner ultrason probu kullanarak, fare karaciğeri görüntüleri elde edin. Beş mikrolitrelik bir mikro şırınga kullanarak, 5. hiPSC-CM'lere yaklaşık 3 x 10 çizin.
Şırıngayı tutun ve sol paraksifoid işlemde üç milimetrelik bir iğne yerleştirin. Ultrason rehberliğinde, diyaframın üst kenarını takip edin. Solunum ritmini ve aralığını gözlemleyin.
Ekspiratuar dairenin sonunda perikarda girin, karaciğer ve akciğere zarar vermekten kaçının. Daha sonra B modu ekokardiyografi ile fare kalbinin parasternal uzun eksenli görüntüsünü elde edin. Ultrasonik rehberlik altında, enfarktüs bölgesinin üç marjinal alanının her birine 5. hiPSC-CMs hücrelerine 1 x 10 enjekte edin.
Ultrason probunu çıkarın ve jöleyi durulayın. Fareyi anesteziden çıkarın ve kafesine geri koyun. Transplantasyondan sonra bir ay boyunca sürekli olarak siklosporin A enjekte edin.
Sol ventrikülün ekokardiyografisi, miyokard enfarktüsüne bağlı yaralanmaların çoklu doz grubunda tersine döndüğünü gösterdi. HiPSC-CM'lerin transplantasyonu ayrıca ejeksiyon fraksiyonunun ve fraksiyonun kısalmasına neden oldu. Sirius Kırmızı ve Hızlı Yeşil boyama kullanılarak kardiyak parametrelerin ölçümü, enfarkt boyutunun ve kollajen hacim fraksiyonunun azaldığını, buna karşın sol ventrikül ön duvar kalınlığının transplantasyon sonrası arttığını göstermiştir.
Yeşil renkte spesifik olmayan alfa aktin, mavi renkte DAPI ve kırmızı renkte insana özgü troponin T için etiketleme, enfarktüs ve marjinal enfarktüs bölgesinde nakledilen hücrelerin varlığını göstermiştir. Nakledilen hücrelerin sayısı ve yüzdesi, çoklu doz grubunda tek doza kıyasla daha yüksekti. Miyokard enfarktüsünden 28 gün sonra, çoklu doz grubu, endotel hücre belirteci I-B4'ü eksprese eden hücre sayısında bir artış gösterdi.
Kardiyomiyositler üzerinde buğday tohumu aglutinin ve sarkomerik alfa aktinin boyanması, minimum lif çapında bir azalma gösterdi. Çoklu doz grubunda tünel pozitif kardiyomiyosit çekirdeği sayısının daha düşük olması apoptozun azaldığını göstermiştir. PCR analizi, insan mitokondriyal DNA'sını sadece kalpte tespit etti ve spesifik transplantasyonu gösterdi.
İğneyi yerleştirirken, karaciğer veya akciğerin zarar görmesini önlemek için diyaframın üst kenarı ve ekspiratuar dairenin sonunda perikardiyal boşluğa girdiğinden emin olun.
