Hemofilus influenzası, KOAH ve pnömoni gibi çeşitli kronik akciğer hastalıklarında inflamasyonun önemli bir nedenidir. Bu protokol, hemofilusun akciğer iltihabı üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılan yöntemleri açıklar. Bu tekniğin avantajları, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesine izin vermesidir.
450 mikrolitre periferik kanı, 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 20 dakika boyunca beş mililitrelik bir tüpte 50 mikrolitre aktif propidium iyodür ile 50 mikrolitre aktif propidium iyodür ile inkübe edin. Numuneyi su banyosundan çıkarın, 10 saniye boyunca beş mikrolitre DHR ve vorteks ekleyin. Sonra 10 dakika daha su banyosuna geri yerleştirin.
Numuneyi su banyosundan çıkardıktan sonra, eritrositleri beş mililitre% 0.8 amonyum klorür çözeltisi ile lize edin ve numuneleri metinde açıklandığı gibi bir akış sitometresinde analiz edin. Kontrol ve antijen stimülasyonu için periferik kan örneğini alikotlara bölün. Her iki örneğe de yardımcı uyarıcı antikorlar ekleyin.
Daha sonra antijen örneğine yazılamayan H influenzae'yi ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra, Golgi bloke edici ajan brefeldin A'yı numunelere ekleyin ve beş saat daha inkübe edin. Daha önce gösterildiği gibi eritrositleri lize ettikten sonra, lökositleri bir saat boyunca% 2 ila% 2 para-formaldehit içeren 500 mikrolitre kullanarak sabitleyin.
Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın, ardından 15 dakika boyunca 100 mikrolitre% 0.1 saponin ile 1 milyon hücreyi geçirgenleştirin. Daha sonra, hücreleri uygun floresan etiketli antikorlarla inkübe edin. Hücreleri yıkayın, ardından bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.
İlgili lenfosit popülasyonlarını alarak antijene yanıt veren hücrelerin oranını belirleyin. Analiz edilecek tüm sitokinler için uyarılmamış hücreler üzerinde arka plan boyama yapın. Lobektomi örneğinin yaklaşık 20 ila 40 gramını üç ila beş milimetreküp bölüme dilimleyin.
Bunları steril 50 mikrolitrelik bir haznenin içine yerleştirin ve uygun bir ayrıştırıcı kullanarak dokuyu mekanik olarak parçalayın. Doku ayrışmasından sonra, gösterildiği gibi kırmızı kan hücrelerini lize edin ve steril RPMI'daki hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra hücreleri 100 mikrometrelik steril naylon bir ağdan filtreleyin ve tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
Enfeksiyon testi için, RPMI'daki akciğer hücrelerini, tüp başına mililitre başına 4 milyon hücrelik son bir konsantrasyona kadar askıya alın. Daha sonra hücreleri, hücre başına 100 bakterilik bir MOI'de enfekte edin. Tüplerde gaz transferine izin vermek için kapağı yarım rotasyonla gevşetin.
Hücreleri tüp rotatöre yerleştirin ve 12 RPM'de dönerken 37 santigrat derecede inkübe edin. Stimülasyondan bir saat sonra, sitokinlerin hücre dışı ihracatını önlemek için grefeldin A ekleyin ve hücre süspansiyonlarını rotasyonla 16 ila 22 saat daha inkübe edin. Ertesi gün, hücre süspansiyonunu% 1 sığır serum albümini ve% 0.01 sodyum azid içeren 500 mikrolitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra, spesifik insan lenfositleri hücre yüzey belirteçleri için hücre süspansiyonunu bir saat boyunca lekeleyin. Daha sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve daha önce gösterildiği gibi sabitleyin ve geçirgenleştirin. Daha sonra, hücreleri bir saat boyunca hücre içi sitokin boyama antikorları ile inkübe edin.
Daha sonra hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresinde veri toplamadan önce 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Metalloproteinazların etkisiyle proteolizi ölçün, floresein etiketli jelatin substratını doğrudan akciğer dokusu kesit slaytlarına ekleyin. Slaytları yatay olarak yerleştirin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede hafif korumalı nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
Negatif kontrolleri hazırlamak için, daha fazla analiz için bölümlere floresan jelatin içermeyen bir x reaksiyon tamponu ekleyin. Periferik kan mononükleer hücreleri, fagosit popülasyonunu tanımlamak için ileri ve yan saçılma kullanılarak kapılandırıldı. Fagosit popülasyonu, monositleri etiketlemek için CD14 ekspresyonu ile daha da tanımlanmıştır.
ROS ölçümü, floresan üretmek için DHR 123'ün oksidasyonu yoluyla gerçekleştirildi. Uyarılan numunenin medyan floresansı kontrol ile karşılaştırıldı. Lenfositlerle hücre içi sitokin üretimi akım sitometrisi kullanılarak ölçüldü.
Hücreler önce lökosit belirteci CD45'in ekspresyonu için ve daha sonra CD üç ve CD dört, CD sekiz için analiz edildi. CD üç, CD dört pozitif hücre, kontrol ve uyarılmış örneklerde hücre içi sitokin üretimi açısından değerlendirildi. Proteaz aktivitesi sabit olmayan akciğer dokusu kesitlerinde NC iki zimografi ile ölçüldü.
Floresan boyama, kromatin ekspresyonu ile birlikte lokalize olan MMP aktivitesinin varlığını gösterdi. Akciğer dokusu örneklerine antikor eklenmesi konsantrasyon gerektirir ve hücrelerin boyanması ön deneylerde optimizasyon gerektirecektir. Akciğer dokusu örneklerinin süpernatanı, ELISA gibi teknikler kullanılarak diğer inflamatuar mediatörler için daha fazla analiz edilebilir ve Bu teknikler, potansiyel tedavilerin akciğer iltihabı üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.
