Bu prosedürün genel amacı, kendi ortamlarında olgunlaşan fare megakaryositlerinden proplatelet oluşumunu gerçek zamanlı olarak takip etmektir. Bu yöntem basit, tekrarlanabilir ve hızlı olma avantajına sahiptir. Birçok megakaryosit analiz edebilir ve profilaklet oluşumunu sadece altı saat içinde görselleştirebilir, bunun yerine kültürün ilk gününü beklemek yerine fare megakaryositleri in vitro.
Bu yöntemin ilginç bir uygulaması, özellikle proplatelet uzantısı adımında farmasötik tedavinin veya genetik mutasyonun etkisini incelemek için bir olasılıktır. Burada in-vitro kültürde olduğu gibi farklılaşma sürecine müdahale yoktur. Bu video, kemik iliğini yıkamanın ve kesmenin bu önemli adımlarını sağlamaya yardımcı olur.
Ayrıca, trombofilik hastalıkta kusurların karakterizasyonu için gerçekten yararlı olan morfoloji ve megakaryositlerin nasıl sınıflandırılacağı açıklanmıştır. Başlamak için, Tyrode'un tamponu 37 santigrat derecede ısıtın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye getirmek için mikroskobun ısıtma odasını açın. Zamanlayıcı, kuluçka odaları, beş mililitre 21 kalibre şırıng, forseps, jilet, Pasteur pipetler, cam kaydıraklar ve 15 mililitre santrifüj tüpü gibi gerekli tüm araçları hazırlayın.
Diz tarafındaki uyluk kemiğinin açıklığı içine 21 kalibrelik bir iğne sokarak kemik iliğini iki mililitre Tyrode tamponu ile yıkayın ve sağlam bir ilik silindirini almak için pistona yavaşça bastırın. Sağlam kemik iliğini dikkatlice ve nazikçe cam bir kaydırağa aktarmak için üç dakikalık litrelik plastik pipet kullanın. Yıkama anında sıkıştırılmış olabilecek iliğin uçlarını kesin.
Daha sonra megakaryositlere zarar vermemek için keskin bir jilet kullanarak 0,5 milimetre kalınlığında ince transversal bölümleri kesin. Plastik bir pipet kullanarak, Tyrode'un tamponu içeren bir mililitrelik bir tüpe 10 bölüm toplayın. Bölümleri dikkatlice 13 milimetre çapında bir kuluçka odasına aktarın.
Tamponu epire edin ve hacmi%5 fare serumu ile desteklenmiş 30 mikrolitre Tyrode tamponu olarak ayarlayın. Bölümleri bir mesafede konumlandırın. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için kapak kaymasını eğimli olarak 22 ila 55 milimetrelik bir kapak kayması ile kendinden yapışkanlı odayı kapatın.
Odayı ısıtma odasına 37 santigrat derecede yerleştirin. Kronometreyi başlatın ve deneyi 37 santigrat derecede altı saat çalıştırın, Megakaryositlerin dönüşümini kaydetmek için videolar yapın. 30 dakika sonra, ilik hücreleri yavaş yavaş bir mono tabaka oluşturan eksplantın çevresine göç etti.
Bir saatlik inkübasyondan sonra, megakaryositler büyük boyutları ve polilobulated çekirdekleri ile tanımlanabilir. Megakaryositlerin sayısı üç saatlik inkübasyondan sonra artar ve bazılarının uzun uzantıları vardır. Kuluçka odasındaki her bölümü yerelleştirmek için bir harita çizin.
Bir saat sonra, her bölümün çevresindeki dev polilobulated hücreler olan görünür megakaryositleri tanımlayın ve çizimdeki konumlarını çizin. Üç ve altı saat sonra bu işlemi tekrarlayın. Megakaryositler elle sayılır ve inkübasyon odasının sızdırmazlığından üç ve altı saat sonra morfolojilerine göre sınıflandırılır.
Küçük, kalın niyetli büyük ve proplatelet uzatma olarak sınıflandırılırlar. Haritalama yardımıyla, evrimleri zaman içinde takip edilebilir. Sonuçlar, her gözlem zamanında her sınıfın yüzdesi olarak ifade edilir.
Klasik olarak, çevrede görülebilen megakaryositlerin yarısı, vahşi tip fare kemik iliği için proplateletleri altı saatte uzatır. Yuvarlak megakaryositlerin kaderi, zaman içinde proplateletleri nasıl oluşturduklarını görmek için sıralı görüntüler yakalayarak takip edildi. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken önemli bir şey, eksplantları deney süresince 37 santigrat derecede tutmaktır.
Farklı bir sıcaklık sonuçları değiştirebilir. İlginçtir ki, explant protokolü içe dönük mikroskopi deneylerinden sonra kullanılabilir. Sonunda kemik iliği eksplantlarındaki megakaryositler doğal olarak floresan olacak ve davranışları kolayca araştırılabilir.
Bu, aynı hayvanlar üzerinde farklı tedaviyi birleştirmeyi ve böylece fare sayısını azaltmayı mümkün khaline getirir. Sonuç olarak, explant yöntemi hızlı, basittir ve doğal megakaryositlerin dış proplateletlere kapasitesi hakkında birçok bilgi sağlar. Ortaya çıkan nitel ve nicel bulgu trombofilik hastalığı anlamamızın anahtarıdır.
fizyolojik veya patolojik bağlamda.
